臭椿酮誘導人黑色素瘤A375細胞凋亡及其機制研究

陳小宇，陳 穎，曲傳俊，李德芳，鄭秋生,2*

1濱州醫學院中西醫結合學院，煙臺 264000；2石河子大學藥學院 新疆特種植物藥資源省部共建重點實驗室，石河子 832000

惡性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)是一種極具侵襲性的腫瘤，好發于皮膚表面。皮膚惡性黑色素瘤的死亡率占皮膚相關腫瘤死亡率的80%[1]，其發生率與死亡率多年來一直高居不下[2,3]。據資料統計，2012年全球黑色素瘤新發病例為232 000例，死亡55 000例，死亡率占新發病例的23.7%[4]；2011年我國黑色素瘤新發病例6 505例，死亡病例2 660例，死亡率占新發病例的40.9%[5]，黑色素瘤已成為嚴重危害我國人民健康的疾病之一，因此開發與研究黑色素瘤治療藥物顯得尤為重要。

臭椿Ailanthusaltissima(Mill.) Swingle，又名椿樹和木礱樹，屬落葉喬木，因葉基部腺點發散臭味而得名，其樹皮、根皮、果實均可入藥，具有清熱燥濕、收澀止帶、止瀉、止血之功效[6]。臭椿酮是臭椿樹葉中分離的一種苦味素類化合物，具有廣譜的生物活性，包括抗炎、抗HIV、抗瘧疾、抗過敏、抗潰瘍和抗微生物等[6]。近幾年研究發現，臭椿酮也具有抗腫瘤活性，并在人前庭神經鞘瘤細胞[7]、人肝癌Huh7細胞[8]、人前列腺癌C4-2B細胞[9]、人胃癌SGC-7901細胞[10]、人非小細胞肺癌A549，H1299和H1975細胞[11]、人乳腺癌MCF-7細胞[12]、人早幼粒急性白血病HL-60細胞[13]中得以驗證。但是，臭椿酮對黑色素瘤的影響未見報道。因此，本研究以人黑色素瘤A375細胞為研究對象，通過多種分子生物及生物化學手段檢測了臭椿酮對人黑色素瘤A375細胞生長增殖的影響，并探討了可能的分子機制。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

臭椿酮(Ailanthone，AIL)購于寶雞辰光生物科技有限公司，純度≥98%。DMEM培養基購于Hyclone公司；胎牛血清購于Gibco公司；青霉素-鏈霉素和胰蛋白酶消化液購于索萊寶生物科技有限公司。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購于碧云天生物技術有限公司；BCA蛋白定量試劑盒和Hoechst 33258細胞凋亡檢測試劑盒購自索萊寶生物科技有限公司；caspase-3和caspase-9活性檢測試劑盒均購于碧云天生物技術有限公司；p-PI3Kβ(Ser1070)，PI3Kβ，p-Akt (Ser473)，Akt和β-actin抗體購自Cell signaling公司，山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗均購自索萊寶生物科技有限公司，ECL發光試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司。分析純化學試劑均購自山東濟南匯豐達化工有限公司。

1.2 儀器

二氧化碳培養箱購自Thermo公司，超凈工作臺購自蘇州凈化設備有限公司，多功能酶標儀購于Tecan公司，AXIO OBSERVER A1倒置熒光顯微鏡購自Carl Zeiss AG公司，BD FACSCalibur流式細胞儀購自BD公司，垂直電泳儀購自Bio-RAD公司，UVP凝膠成像系統購于美國BioSpectrum公司。

1.3 細胞及培養

人黑色素瘤A375細胞購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養，并加入100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每2天傳代一次。

2 實驗方法

2.1 MTT法檢測藥物對細胞活力的影響

取對數生長期的A375細胞，以每孔4×103個接種于96孔板，每組設置6個復孔。次日，待細胞貼壁后，加入0、4、8、12 μM臭椿酮作用24 h。待培養結束后，每孔加入5 g/mL MTT試劑20 μL，繼續培養4 h。孵育結束后，棄去孔內培養液，每孔加入150 μL DMSO，置于微孔振蕩器上振蕩10 min，使紫色結晶完全溶解，用多功能酶標儀在570 nm處測定吸光度。并依據公式計算細胞存活率：

細胞存活率=實驗組吸光度/對照組吸光度×100%

2.2 倒置相差顯微鏡觀察細胞形態

取對數生長期的A375細胞2×105個/孔接種于6孔板中。次日，待細胞融合度達到70%時，加入0、4、8、12 μM臭椿酮，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h。之后，將培養板從培養箱中取出，置于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。

2.3 Hoechst 33258染色

取對數生長期的A375細胞2×105個/孔接種于6孔板中。次日，待細胞融合度達到70%時，加入0、4、8、12 μM臭椿酮作用24 h。待培養結束后，棄去孔內培養基，用PBS潤洗2～3次，用4%多聚甲醛室溫固定20 min，之后棄去固定液，用PBS潤洗2次，吸出孔內液體，加入Hoechst 33258染色液500 μL，室溫避光染色30 min，棄去染色液，用PBS潤洗2次，置于熒光顯微鏡下觀察細胞形態變化并拍照。

2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

取對數生長期的A375細胞2×105個/孔接種于6孔板中。次日，待細胞融合度達到70%時，加入0、4、8、12 μM臭椿酮作用24 h。待培養結束后，棄去孔內培養基，用PBS潤洗2～3次，按照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書上的操作收集細胞并分別加入Annexin V-FITC和PI，室溫避光染色20 min后。離心收集細胞，棄去熒光染液，用試劑盒中提供的緩沖液潤洗細胞3次，最后加入500 μL緩沖液，用流式細胞儀檢測。

2.5 Caspase-3和caspase-9的活性檢測

取對數生長期的A375細胞2×105個/孔接種于6孔板中。次日，待細胞融合度達到70%時，加入0、4、8、12 μM臭椿酮作用24 h。待培養結束后，棄去孔內培養基，用PBS潤洗2次，用胰蛋白酶消化細胞，600 g在4 ℃離心5 min收集細胞沉淀，加入200 μL試劑盒中提供的裂解液，冰浴裂解15 min，取該溶液于4 ℃用16 000 g離心15 min，將上清轉移至新的離心管中備用。取待測溶液50 μL，加入40 μL檢測緩沖液及10 μL底物，于405 nm處測定樣品吸光度。把試劑盒提供的pNA(p-nitroaniline)(10 mM)稀釋至0、10、20、50、100 μM，每個濃度取100 μL并設置3個復孔用酶標儀在405 nm處進行檢測，制作出pNA濃度相對于A405的標準曲線。用樣品的A405的數值在標準曲線上比對，可以得到相應的pNA濃度，用pNA濃度大小表示caspase-3和caspase-9活性的高低。

2.6 Westerm blot檢測相關蛋白表達

取對數生長期的A375細胞2×105個/孔接種于6孔板中。次日，待細胞融合度達到70%時，加入0、4、8、12 μM臭椿酮作用24 h。待培養結束后，棄去孔內培養基，用PBS潤洗2次，用胰蛋白酶消化細胞，600 g在4 ℃離心5 min收集細胞沉淀，加入800 μL RIPA細胞裂解液，置于冰上裂解30 min后，1 000 g在4 ℃離心10 min后取上清，用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，之后取適量蛋白溶液與上樣緩沖液按比例混勻，于沸水中煮15 min使蛋白變性，取40 μg蛋白上樣，采用10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，用濕轉法將蛋白轉印至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，加入相應的一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，之后用TBST洗3次，加入相應的二抗于室溫在搖床搖2 h，用TBST潤洗3次后用ECL發光試劑盒顯色，用UVP凝膠成像系統記錄圖像。

2.7 統計學分析

實驗數據以平均值±標準差(Mean±SD)表示，用SPSS 19.0軟件單因素方差(ANOVA)進行分析，P<0.05認為具有統計學意義。

3 結果與分析

3.1 臭椿酮對A375細胞活力的抑制作用

臭椿酮(0、4、8、12 μM)作用A375細胞24 h后，用MTT法檢測臭椿酮對人黑色素瘤A375細胞活力的影響。如圖1所示，臭椿酮(4、8、12 μM)作用A375細胞24 h后，能夠明顯抑制A375細胞活力且呈現劑量依賴性。其中12 μM臭椿酮作用A375細胞24 h后，使A375細胞活力下降78.9%。

圖1 臭椿酮對人黑色素瘤A375細胞活力的抑制作用Fig.1 Inhbitory effect of AIL in human melanoma A375 cells注：Ctrl為對照組，*與對照組相比有顯著差異(P<0.05)，**與對照組相比具有非常顯著差異(P<0.01)。Note:Ctrl means control group,*significant difference with control group (P<0.05),very significant difference with control group (P<0.01).

圖2 不同濃度臭椿酮作用A375細胞24 h后細胞形態的變化Fig.2 Morphological change of A375 cells treated with different concentrations of AIL for 24 h注：Ctrl為對照組。Note:Ctrl means control group.

3.2 臭椿酮對A375細胞形態的影響

臭椿酮(0、4、8、12 μM)作用A375細胞24 h后，將6孔板從培養箱中取出，置于倒置相差顯微鏡下觀察細胞數目和形態變化。如圖2所示，臭椿酮作用后A375細胞的數目明顯減少，并呈現劑量依賴性。隨著臭椿酮劑量的增加，A375細胞變的更圓，其中12 μM臭椿酮作用A375細胞24 h后，A375細胞明顯變小、數目變少，并且透光性降低，還使A375細胞的附著力變弱，上清液出現許多漂浮的細胞。

3.3 臭椿酮對A375細胞核形態的影響

臭椿酮(0、4、8、12 μM)作用A375細胞24 h后，用Hoechst 33258熒光染料對A375細胞進行染色來檢測AIL對A375細胞核形態的影響。如圖3所示，臭椿酮作用后細胞數目相較于正常組明顯減少(表現為細胞核數目減少)，還可以觀察到A375細胞染色質出現濃縮進而產生的高亮，而對照組細胞核亮度較低，邊緣光滑完整，染色質分布均勻。

圖3 臭椿酮對A375細胞核形態的影響 (200 ×)Fig.3 The effect of AIL on cell nuclear feature in A375 cells (200 ×)注：Ctrl為對照組。Note:Ctrl means control group.

3.4 臭椿酮對A375細胞凋亡的影響

臭椿酮(0、4、8、12 μM)作用A375細胞24 h后，用Annexin V-FITC和PI染料進行雙染，接著用流式細胞儀進行檢測。如圖4所示，與正常組相比，臭椿酮作用組細胞凋亡率明顯增加，表現在Q4象限(早期凋亡)和Q2象限(晚期凋亡)細胞數均明顯增加。

圖4 臭椿酮能夠誘導A375細胞凋亡Fig.4 AIL induced apoptosis of A375 cells注：Ctrl為對照組，PI為碘化丙啶，FITC為異硫氰酸熒光素。Note:Ctrl means control group,propidine iodide is represented as PI,fluorescein isothiocyanate is represented as FITC.

3.5 臭椿酮對A375細胞caspase-3和caspase-9活性的影響

臭椿酮(0、4、8、12 μM)作用A375細胞24 h后，與正常組對比，不同濃度臭椿酮作用后caspase-3和caspase-9的活性增加，其中8 μM和12 μM臭椿酮作用后，能夠使caspase-3的活性顯著增加，臭椿酮(4、8、12 μM)作用后能夠使caspase-9的活性顯著增加。

3.6 臭椿酮對A375細胞PI3K/Akt信號通路的影響

臭椿酮(0、4、8、12 μM)作用A375細胞24 h后，用Western blot檢測臭椿酮作用后對PI3K/Akt信號通路蛋白表達的影響。如圖5所示，與對照組相比，不同濃度臭椿酮作用后p-PI3K和p-Akt表達明顯下降，說明臭椿酮能夠抑制PI3K和Akt的磷酸化，而PI3K和Akt總蛋白并無明顯變化。上述結果說明，臭椿酮能夠使PI3K/Akt信號通路失活。

Table 1 Effect of AIL on caspase-3 and caspase-9 activities in A375 cells (n =

注：與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01。

Note:Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01.

圖5 臭椿酮作用A375細胞后對PI3K/Akt信號通路蛋白表達的影響Fig.5 Effect of AIL on the expression of PI3K/Akt signaling pathway proteins in A375 cells注：Ctrl為對照組。Note:Ctrl means control group.

圖6 臭椿酮聯合LY294002對PI3K/Akt信號通路蛋白表達的影響Fig.6 Effect of AIL combined with LY294002 on the expression of PI3K/Akt signaling pathway proteins注：Ctrl為對照組。Note:Ctrl means control group.

3.7 臭椿酮使PI3K/Akt信號通路失活來誘導A375細胞凋亡

LY294002是PI3K特異性抑制劑，用LY294002預處理2 h后，再加入0、4、8、12 μM臭椿酮作用A375細胞24 h，用Western blot檢測臭椿酮作用后對PI3K/Akt信號通路蛋白表達的影響。如圖6所示，臭椿酮作用A375細胞后對總PI3K和Akt的表達沒有明顯影響，但是使磷酸化PI3K和Akt表達明顯下降，當臭椿酮和PI3K抑制劑LY294002聯用后，使磷酸化PI3K和Akt表達下降更為明顯，進一步說明臭椿酮能夠使PI3K/Akt信號通路失活。

接著，我們又檢測了LY294002聯合臭椿酮對A375細胞凋亡的影響，發現與只臭椿酮處理組相比，臭椿酮與LY294002聯用后使A375細胞凋亡數明顯增加，進一步確認了臭椿酮通過使PI3K/Akt信號通路失活來誘導A375細胞凋亡。

圖7 臭椿酮通過PI3K/Akt信號通路誘導A375細胞凋亡Fig.7 AIL induced apoptosis of A375 cells via PI3K/Akt signaling pathway注：Ctrl為對照組，PI為碘化丙啶，FITC為異硫氰酸熒光素。Note:Ctrl means control group,propidine iodide is represented as PI,fluorescein isothiocyanate is represented as FITC.

4 結論

黑色素瘤是一種惡性程度相當高的腫瘤，大多原發于皮膚，也可起源于眼、鼻腔等處，早期可發生轉移，轉移部位多見肺、腦，黑色素瘤的死亡率之高已嚴重危害我國人民健康。因此，尋找低毒、高效的抗癌藥物是黑色素瘤治療領域的重要方向。

臭椿酮是臭椿中的一種化合物，具有抗炎、抗HIV、抗瘧疾、抗過敏、抗潰瘍和抗微生物的生物活性，還能夠通過提升自身免疫而發揮多種治療作用[6]。Zhuo等[8]發現臭椿酮能夠通過激活ATM/ATR信號轉導通路抑制人肝癌HepG2、Hep3B、Huh7細胞增殖并導致人肝癌細胞周期阻滯。He等[9]發現在難去勢的前列腺癌細胞中臭椿酮通過靶向p23克服MDV3100耐藥。Chen等[10]發現臭椿酮通過誘導G2/M期阻滯和凋亡來抑制人胃癌SGC-7901細胞增殖。Ni等[11]通過cDNA基因序列的方法探索了臭椿酮抑制非小細胞肺癌增殖的作用機制，發現臭椿酮作用后會下調RPA1進而抑制非小細胞肺癌DNA復制。Wang等[12]發現臭椿酮能夠誘導人乳腺癌MCF-7細胞凋亡和周期阻滯。Wei等[13]發現臭椿酮通過誘導凋亡和自噬抑制人早幼粒急性白血病HL-60細胞增殖。Rosati等[14]發現臭椿酮能夠誘導Jurkat細胞線粒體膜電勢下降并激活caspase-3，進而誘導Jurkat細胞凋亡。目前尚未見有關臭椿酮對黑色素瘤影響的報道。本實驗以臭椿酮為研究對象，探討了臭椿酮對人黑色素瘤A375細胞增殖、凋亡的影響及作用機制。

在光學顯微鏡下觀察，凋亡細胞和未凋亡的細胞有著明顯的形態變化，凋亡的細胞體積變小，貼壁細胞出現皺縮、變圓、附著力變弱的現象。細胞發生凋亡時，染色質會發生固縮，Hoechst 33258是一種著色于DNA的染料，因此在Hoechst 33258染色后，用熒光顯微鏡觀察可以發現凋亡細胞的細胞核會呈現致密濃染或碎塊化致密濃染，顏色發白呈現高亮[15,16]。磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)正常位于細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。Annexin V是一種分子量為35～36 KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。碘化丙啶(propidium iodide,PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但對于凋亡中晚期的細胞和壞死的細胞，由于其細胞膜破裂，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅[17]。因此，用Annexin V和PI雙染能夠標記凋亡細胞和壞死的細胞。Caspase-9也稱為ICE-LAP6或Mch6，是細胞凋亡信號轉導過程中比較上游的一個caspase，線粒體釋放細胞色素C后，caspase-9可以和細胞色素C和Apaf1形成復合物，同時被激活?；罨腸aspase-9可以激活caspase-3從而促進后續的細胞凋亡信號[18,19]。我們的實驗結果發現，臭椿酮作用后使A375細胞變小、透光性降低，附著力變弱表現為上清液出現許多漂浮的細胞；Hoechst 33258染色后，用熒光顯微鏡觀察，發現臭椿酮作用后能夠使A375細胞染色質出現固縮，從而表現為熒光高亮；Annexin V-FITC/PI雙染后，用流式細胞儀檢測，發現臭椿酮作用后使A375細胞早期凋亡和晚期凋亡的細胞占比均增高；用分光光度法檢測caspase-3和caspase-9的活性，發現臭椿酮作用后與正常組對比，能夠使caspase-3和caspase-9的活性明顯升高。以上結果說明臭椿酮能夠誘導人黑色素瘤A375細胞凋亡。

PI3K/Akt信號通路通過多種途徑參與調控細胞凋亡，其作用機制主要有三個：(1)活化的Akt使促凋亡蛋白Bad磷酸化，使其與伴侶蛋白結合，從而阻斷其與Bcl-2形成二聚體，最終導致Bad促凋亡作用喪失；(2)調控細胞周期，從而促進細胞增殖。Akt磷酸化可以激活其下游分子mTOR，激活的mTOR可以將信號傳遞給S6K1和4E-BP1，S6K1和4E-BP1活化后會使細胞由G0/G1期進入S期，進而促進細胞增殖；(3)在凋亡信號的刺激下，線粒體滲透性轉換孔開放，線粒體膜通透性增加，線粒體膜電位下降，細胞色素C釋放，激活caspase級聯反應，繼而導致細胞凋亡。Akt激活后能夠抑制細胞色素C的釋放，從而產生抗凋亡的作用[20]。本研究發現，臭椿酮作用A375細胞后，對總PI3K和Akt的表達沒有明顯影響，但是使磷酸化PI3K和Akt表達明顯下降，并且當臭椿酮和PI3K抑制劑LY294002聯用后，使磷酸化PI3K和Akt表達下降更為明顯，并且凋亡的細胞數明顯增加，進一步說明PI3K/Akt信號通路參與臭椿酮誘導的人黑色素瘤A375細胞凋亡。

綜上所述，臭椿酮對人黑色素瘤A375細胞的增殖有明顯的抑制作用，并且能夠誘導其凋亡，主要通過上調caspase-3和caspase-9的活性和使PI3K/Akt信號通路失活來實現。我們的實驗結果表明，臭椿酮具有體外抗黑色素瘤細胞的作用，為開發抗黑色素瘤的藥物提供了理論依據。