秦皮甲素對AGEs致損的ECV304細胞增殖及氧化應激的影響

李 甘，夏大靜

1楚雄州人民醫院輸血科，楚雄 675000；2浙江大學公共衛生學院，杭州 310058

糖基化終末代謝產物(AGEs)是葡萄糖與各種蛋白質、核酸或脂質大分子在非酶的條件下形成的糖基化代謝產物，該反應在體內可緩慢進行，隨著年齡的增長而逐漸增加，而在糖尿病或尿毒癥患者中該反應速度顯著加快，形成量明顯增多。AGEs可以通過多種機制對全身許多組織及器官產生損害，在糖尿病中研究較多，被認為是糖尿病血管病變的觸發因素[1]。AGEs通過作用于血管內皮細胞，可以使其結構和功能受到影響。有多種阻止AGEs累積與形成的治療方法，降糖藥如二甲雙胍[2]、氨基胍類化合物、ALT 946吡哆胺(pyridoxamine)等[3]，它們分別可以通過不同途徑阻滯AGEs形成，而AGEs裂解劑可以裂解已經形成的AGEs交聯結構。有研究表明[4]，AGEs抑制劑以及AGEs交聯結構裂解劑，可以從不同的階段阻斷AGEs的形成，特別是AGEs裂解劑能夠逆轉或軟化由AGEs造成的組織、器官以及血管的硬化，有希望成為一類新型治療藥物，尤其針對眼底和腎組織的終末血管變化。

秦皮甲素(Esculin)為木犀科植物苦櫪白蠟樹(FraxinusrhynchophyllaHance)、白蠟樹(FraxinuschinensisRoxb.)、尖葉白蠟樹(FraxinusszaboanaLingelsh)或宿柱白蠟樹(FraxinusstylosaLingelsh.)等4種干燥枝皮或干皮提取物。最早見于漢代的藥學專著《神農本草經》，中國《本草綱目》對該味藥的表述為：“秦皮，治目病，驚癎，取其平木也?！蓖瑫r也有《淮南子》：“秦皮色青，治目之要藥也”?，F代藥理研究表明[5]，秦皮具有抗炎鎮痛、降低尿血酸、抗凝、止咳祛痰平喘以及抗腫瘤作用，主要用于治療腸炎、痢疾、白帶、慢性氣管炎、結膜炎，用于治療痛風效果甚佳。秦皮中主要成分為香豆素類(含秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮素、宿柱白蠟苷、6，7-二甲氧基香豆素等)[6]，此外還有酚類、皂苷和鞣質等。秦皮甲素可以改善鏈脲菌素(Streptozotocin,STZ)誘導的糖尿病小鼠的血脂異常、炎癥反應、以及腎損傷[7]。有文獻證明AGEs通過損傷內皮細胞可導致內皮細胞功能紊亂，最終引起糖尿病等血管并發癥的發生[8]?；谔悄虿∫约敖K末腎病中AGEs的大量生成及所產生的生物學效應。本實驗應用AGEs作用人臍靜脈內皮細胞系(ECV304)，模擬糖基終末化產物對內皮細胞的損傷，并用秦皮甲素干預，觀察對ECV304增殖和氧化應激指標的影響?？疾烨仄ぜ姿貙GEs損傷后內皮細胞功能的研究，探討其機制是否與抑制糖基化終末產物(AGEs)的生物學活性有關，將有助于進一步闡明秦皮甲素是否存在潛在的血管保護作用，為進一步的臨床應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

秦皮甲素，成都曼思特生物科技有限公司(貨號：A0020，純度：HPLC≥98%)；無水乙醇，北京化學試劑廠；青霉素，華北制藥有限公司；鏈霉素，華北制藥有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)，福州邁新生物技術開發有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(貨號：20180326)、活性氧(ROS)測定試劑盒(化學熒光法)(批號：20180326)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號：20180326)、一氧化氮(NO)測定試劑盒(批號：20180326)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(批號：20180326)、甘油三酯(TG)測定試劑盒(批號：20180326)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL)(批號：20180326)、總膽固醇(CHO)測定試劑盒(批號：20180326)均由南京建成生物工程研究所提供；非對稱二甲基精氨酸(ADMA)檢測試劑盒為美國CUSABIO公司提供(批號：CSB-E09298h)；ECV304細胞為寧波醫學科學研究所藥理室贈送，經免疫熒光鑒定，eNOS和vWF均為陽性；DMEM培養基，Trypsin，胎牛血清 (FBS)均購自Life technology公司；溴乙錠(EB)、CCK-8為Dojindo產品；二甲亞砜購自國藥化學試劑有限公司；Trizol試劑購自invitrogen公司；逆轉錄及SYBR Green I Real Time PCR試劑購自大連寶生物公司；引物由GENEWIZ(金唯智)合成;血管內皮細胞粘附因子-1(VCAM-1，貨號：ab212937)和細胞間粘附因子1(ICAM-1，貨號：ab171123)抗體均為Abcam公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 AGEs的制備

參照文獻的方法[9]，用凍干牛血清白蛋白和糖制備無內毒素的糖基化修飾的牛血清白蛋白(AGE-BSA)。

1.2.2 細胞培養

ECV304的培養液為含10% FBS的DMEM培養基，用0.25% 的胰蛋白酶消化傳代后，將ECV304置37 ℃、5% CO2培養箱內靜置培養，2天換液1次。實驗所用細胞為第6～8代。

1.2.3 CCK-8檢測細胞活力

取對數生長期細胞制成單細胞懸液，以150 μL/孔接種于96孔板，細胞數2×104/孔，培養24小時后，加入無血清的DMEM培養基，再孵育24小時使細胞生長同步進入休止期(同步化)。吸棄上清液，每組設置6個重復孔，分別加入不同濃度的AGEs達到終濃度(0、25、50、100、150、200、250 mg/L)，培養24小時，CCK-8法觀察不同濃度AGEs對ECV304增殖的影響。同一水平6孔并列，在加入終濃度為200 mg/L AGEs的同時分別給予終濃度為2.5 、5、10、15、20、25 mg/L的秦皮甲素溶液，并設AGEs培養組和DMEM對照組。在37 ℃飽和濕度5% CO2培養箱內培養48小時。取出后，每孔加入16.7 μL CCK-8溶液，37 ℃孵箱繼續培養4小時，用酶標儀檢測波長450 nm時的光密度值[D(450)值]。

1.2.4 氧化應激指標及其相關指標檢測

按照試劑盒說明書收集細胞和培養基上清檢測相應指標： ROS、MDA、LDH、LDL、CHO、TG。對細胞裂解物中的SOD進行檢測。

1.2.5 血管粘附分子檢測

免疫印跡檢測VCAM-1和ICAM-1的表達水平，過程如下：細胞在AGEs和秦皮甲素共同孵育24小時，使用RIPA法裂解，收集細胞裂解液。裂解后，取3 μL裂解液用于二喹啉甲酸法(BCA)定量。蛋白樣品95 ℃孵育10分鐘變性處理，變性后的蛋白-20 ℃保存備用。制備10%的SDS-page膠，進行電泳分離。蛋白分離后經200 mA恒流1.5小時電轉移到PVDF膜后，使用含5%脫脂牛奶的封閉液封閉1小時，與一抗4 ℃孵育過夜，次日加入內參抗體β-actin室溫孵育1小時，洗膜后加入含二抗室溫作用1小時后，TBST洗膜3次，取出膜后加入ECL發光液，暗室中壓片顯影。使用Image J軟件對條帶灰度值進行量化分析，ELISA法確定樣本基本濃度。

1.2.6 RT-qPCR檢測相關基因的表達

收集細胞，參照Trizol試劑說明裂解細胞后提取RNA。引物序列見表1。實時定量PCR 25 μL反應體系由以下成份組成：12.5 μL 2 × Power SYBR Green PCR Master Mix，1.0 μmol/L 上、下游引物，1 μL逆轉錄產物，超純水構成。反應程序為：95 ℃ 10分鐘；循環反應為95 ℃ 8 s，60 ℃ 40 s，40個循環，在各循環的60 ℃ 40 s步驟進行熒光檢測；最后為融解曲線步驟。每個樣品目的基因的表達域值與其內參基因表達域值的差ΔCt為其相對表達量。以2-ΔCt表示為目的基因在藥物處理組的表達量與在正常組表達量的比值。

表1 實時定量 PCR 檢測基因的引物序列

1.2.7 NO以及相關指標檢測

應用Griess法對細胞上清液中NO水平進行檢測。采用酶聯免疫吸附試驗對ADMA進行檢測，操作嚴格遵循說明書實施。

1.2.8 統計學處理

本研究中實驗重復3次以上，計量數據以平均值及標準差(mean±SD)表示，數據結果采用Prism6.0統計軟件進行處理。組間具有方差齊性時，組間比較使用t檢驗，多組比較采用單因素ANOVA分析，方差不齊者采用非參數檢驗。P<0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 秦皮甲素對內皮細胞增殖的影響

AGEs作用ECV304細胞24小時后，如圖1A所示，與空白對照組相比，當AGEs濃度高于50 mg/L時，其存活率顯著降低(P<0.05)。由圖1B可知，不同濃度(2.5、5、10、15、20、25 mg/L)秦皮甲素作用于AGEs致ECV304損傷的細胞，當秦皮甲素的濃度高于15 mg/L時對AGEs致損的ECV304細胞有顯著的保護作用(P<0.05)，同時呈現劑量依賴性。

圖1 秦皮甲素削弱AGEs對ECV304細胞抑制效應Fig.1 Esculin diminished the inhibitory effect of AGEs on ECV304 cells注：A：AGEs對ECV304細胞增殖的影響；B：甲素對AGEs致ECV304損傷影響。*代表與BSA組比較，P<0.05。Note:A:the effect of AGEs on the proliferation of ECV304 cells.B:the effect of esculin on AGEs-treated ECV304 cells.*Compared with the control group,P<0.05.

圖2 秦皮甲素對AGEs誘導ROS形成的影響 Fig.2 Effect of esculin on ROS formation induced by AGEs 注：A：200 mg/L AGEs作用不同時間細胞內ROS的水平；B：不同濃度AGEs對細胞內ROS的生成的影響；C：秦皮甲素作用不同時間后對ECV304細胞內ROS生成的影響；D：秦皮甲素對AGEs作用后ECV304細胞內ROS水平的影響。*代表與control組比較，P<0.05 #代表與control組比較，P<0.05。Note:A:The level of intracellular ROS at different time after treatment with 200 mg/L AGEs.B:The effect of different concentrations of AGEs on the production of ROS in cells.C:The effect of esculin on ROS production in ECV304 cells at different time.D:The effect of esculin on ROS levels in ECV304 cells after AGEs treatment.*Compared with the control group,P<0.05.# Compared with the AGEs model group, P<0.05.

2.2 秦皮甲素對AGEs 誘導的活性氧以及相關酶的影響

測定秦皮甲素對AGEs致損的ECV304細胞中ROS、SOD、MDA、LDH等相關指標的影響。在AGEs作用下，隨著AGEs作用時間的增加，細胞內ROS的濃度隨之增加，呈現劑量與時間依賴性(如圖2A和2B)。細胞中的ROS水平在秦皮甲素作用30分鐘后出現下調趨勢(圖2C)。隨著秦皮甲素作用濃度增加，ROS的水平呈現降低的趨勢(圖2D)，相關酶的表達情況如圖3所示，可以得出經AGEs處理過的細胞，其MDA，LDH，CHO，LDL，TG含量增加，SOD酶活性降低，與空白對照組比較有顯著差異(P<0.01)；而加入秦皮甲素后可提高SOD酶活力，降低MDA、LDH、CHO、LDL、TG含量，與AGEs模型組相比具有顯著性差異(P<0.05)。

圖3 秦皮甲素對氧化應激相關指標的影響Fig.3 Effect of esculin on oxidative stress related indicators 注：A：對SOD酶活性的影響；B：對MDA濃度的影響；C：對LDH濃度的影響；D：對CHO濃度的影響；E：對LDL濃度的影響；F：對TG濃度的影響。*代表與control組比較，P<0.05，#與AGEs模型組比較，P<0.05。Note:A:Effect of esculin on SOD enzyme activity.B:Effect of esculin on MDA concentration.C:Effect of esculin on LDH concentration.D:Effect of esculin on CHO concentration.E:Effect of esculin on LDL concentration.F:Effect of esculin on TG concentration.*Compared with the control group,P<0.05.# Compared with the AGEs model group,P<0.05.

2.3 AGEs 對血管粘附因子表達的影響

在AGEs 作用下VCAM-1和ICAM-1明顯增高，只加入秦皮甲素不會導致VCAM-1和ICAM-1的上升。在添加AGEs的培養基中加入秦皮甲素可以發現，VCAM-1和ICAM-1的含量下降，且VCAM-1隨秦皮甲素濃度增加下調趨勢明顯，而ICAM-1隨秦皮甲素加入降低效果不明顯，在15 mg/L秦皮甲素處理時ICAM-1含量高于AGEs組。表明秦皮甲素選擇性抑制內皮粘附因子的表達。RT-qPCR檢測VCAM-1 mRNA和ICAM-1 mRNA的表達結果發現，在AGEs 作用下VCAM-1 mRNA和ICAM-1 mRNA的表達顯著上調，表達量分別是對照組的5.9±0.2和4.4±0.7倍，在添加AGEs的培養基中加入秦皮甲素后可以發現，VCAM-1 mRNA的表達顯著下調，25 mg/L秦皮甲素處理組的VCAM-1 mRNA表達量僅為對照組的1.4±0.03倍，ICAM-1 mRNA隨秦皮甲素濃度增加降低效果不明顯。

2.4 秦皮甲素對細胞上清液中NO和ADMA的影響

AGEs(200 mg/L)處理內皮細胞可顯著升高細胞培養上清液中ADMA水平，同時下調NO水平。與AGEs(200 mg/L)處理組相比較，可以得到秦皮甲素(25 mg/L)處理組內皮細胞的ADMA水平呈現明顯的下調，有顯著性統計意義(P<0.05)；而秦皮甲素(25 mg/L)處理組內皮細胞NO水平與AGEs(200 mg/L)處理組相比較則明顯的升高(P<0.05)。

3 結論

研究表明，在糖尿病并發癥以及心血管疾病的發生發展中，AGEs通過與其配體結合，通過多種細胞途徑，對內皮細胞造成損傷。在糖尿病并發癥過程中具有重要意義[10]。有不少研究顯示，天然植物中存在可抑制AGEs形成的活性物質，如VB6[11]，粳稻的提取物[12]都可一定程度上削弱AGEs對血管，腎等器官的損傷，探索抑制AGEs的活性物質在糖尿病并發癥的防治中有著重要的意義。

在本研究中，通過構建AGEs培養的人臍靜脈內皮細胞顯示，高濃度的AGEs可對ECV304細胞造成顯著的損傷。在50 mg/L濃度時，即可對細胞增殖造成影響。有研究顯示高濃度的AGEs可誘導ECV304細胞凋亡，并與處理時間和濃度相關[8]。加入AGEs后，臍靜脈內皮細胞ROS含量，MDA以及LDH含量隨即增加，提示在細胞水平存在損傷，與文獻相符[13]。在加入AGEs同時，給予不同濃度的秦皮甲素溶液處理，在一定濃度區間內(15～25 mg/L)，細胞增殖率有顯著差別，同時，前幾項指標出現顯著下降。降低了由AGEs引起的LDH，MDA增加，提示秦皮甲素對細胞的保護作用，且具有劑量依賴性。有研究顯示，秦皮甲素對DPPH等自由基有較強的清除能力[14]，可較好拮抗AGEs帶來的負面效應。本研究進一步證實，秦皮甲素可以抵抗由AGEs誘導的細胞內ROS生成，并與濃度有關。

圖4 秦皮甲素對血管粘附有關分子表達的影響Fig.4 Effect of esculin on expression of vascular adhesion related molecules注：A：不同處理組ICAM-1蛋白的表達水平；B：不同處理組VCAM-1蛋白的表達水平；C：不同處理組ICAM-1 mRNA的表達水平；D：不同處理組VCAM-1 mRNA的表達水平。*代表與control組比較，P<0.05，#代表與AGE-BSA組比較，P<0.05。Note:A:Expression levels of ICAM-1 protein in different treatment groups.B:Expression levels of VCAM-1 protein in different treatment groups.C:Expression levels of ICAM-1 mRNA in different treatment groups.D:Expression levels of VCAM-1 mRNA in different treatment groups.*Compared with the control group,P<0.05.# Compared with AGE-BSA group,P<0.05.

AGEs作用內皮細胞后還可以增加LDL和HDL的糖基化，影響脂質代謝[15 ]，在本次實驗中，檢測脂代謝相關指標CHO，LDL和TG顯示，加入秦皮甲素后顯著改善LDL和TG水平，但不同濃度間未見有統計學顯著?？梢?，秦皮甲素在一定程度上可以改善由AGEs引起的脂質代謝紊亂。

本次實驗還檢測了細胞粘附分子ICAM-1和VCAM-1水平。AGEs與RAGE結合后，可通過核因子kB(NF-kB)引起ICAM-1和VCAM-1表達水平的增高[16]，誘導平滑肌細胞的增殖。加入秦皮甲素后可顯著抵抗由AGEs誘導的VCAM-1水平增加，而對ICAM-1改變并不明顯。在某種程度上抑制平滑肌增生。

內皮細胞產生的縮血管因子和舒血管因子之間的平衡是內皮細胞功能正常的標志。NO起舒張血管平滑肌，保持血管正常功能。ADMA做為L-精氨酸類似物，與精氨酸競爭性地抑制活性，達到減少NO生成，調節NO的生成起著重要作用[17]，ADMA濃度增加時，NO的生成減少。近年來大量的研究證實ADMA也可作為是內皮功能不全的主要標志之一[18]，也是心血管疾病以及糖尿病血管損傷的危險因子。研究顯示[19]，體外培養的內皮細胞中加入AGEs后，NO生成減少和eNOS蛋白表達下調，而ICAM-1的水平增加，本研究中發現，秦皮甲素加入后一定程度上抵抗由AGEs誘導的NO下調，同時可以減少ADMA的上調。

綜上，在本研究中，我們發現秦皮甲素可以從抑制氧化應激，脂質糖基化，抑制血管平滑肌增生，維持血管正常功能等方面保護血管內皮細胞免受AGEs的損傷，通過降低ROS水平，增加抗氧化應激酶SOD含量，NO的水平等抵抗由于AGE對血管帶來的負面影響?？梢钥紤]將秦皮甲素作為糖尿病并發癥防治的候選化合物進行深入研究，從而達到控制AGEs的效應，減少糖尿病患者血管的損傷的效果。