鏈霉菌KIB-H1556次級代謝產物抗植物真菌活性研究

董庭邦，王 磊，桂 瀟，蘇 燦，李 潔，黃勝雄*，王福生*

1大理大學藥學與化學學院，大理 671000；2中國科學院昆明植物研究所 植物化學與西部植物資源持續利用國家重點實驗室，昆明 650201

放線菌(Actinomycetes)廣泛分布于土壤、海洋和湖泊等不同地自然生境中，它們與人類生活息息相關，在醫療、農業、食品、化工和環保等領域具有重要的應用價值[1]。迄今為止，近萬種被發現的天然抗生素中，約 70% 由放線菌產生，其中，鏈霉菌產生的抗生素約占52%[2]。Bafilomycins是具有16元內酯環的大環內酯類抗生素，首次從灰色鏈霉菌的培養物中分離得到[3]。目前，從鏈霉菌中得到的Bafilomycins類化合物有Bafilomycin A～J及其衍生物，該大環內酯類抗生素對革蘭氏陽性菌具有廣譜的殺菌活性，并且具有抗寄生蟲的作用[4,5]。

在我國，玉米是僅次于水稻和小麥的第三大糧食作物以及多種農副產品的原料，并且種植面積較大。近年來，玉米病蟲害日益嚴重，不僅影響了玉米的質量和產量，而且玉米病害的不斷進化和變異，加大了其防治難度和效果。為了尋找新的抗植物病原菌天然活性物質，本課題組對多株鏈霉菌的發酵產物進行活性篩選，發現一株鏈霉菌KIB-H1556的粗提物對植物病原真菌顯示出較好的抑制活性。本實驗對該菌株進行搖瓶發酵，采用活性追蹤的方法，對其次級代謝產物進行分離純化，得到3個化合物。首次發現化合物2和3對玉米大斑病菌、小斑病菌和玉米彎孢病菌等植物病原菌顯示有抑制活性，其具有作為抗植物病原真菌藥物的研究價值。

圖1 化合物1～3的化學結構Fig.1 Chemical structures of compounds 1-3

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Bruker Avance Ⅲ-600型核磁共振儀(TMS作為內標，δ為ppm)，Agilent UPLC/Q-Tof液質聯用儀(Agilent 1290UPLC/6540 Q-TOF)，Hitachi Chromaster高效液相色譜儀(日立)，YMC-Triat C18型液相色譜柱(250 × 10 mm I.D.)，ZQZY-HC恒溫搖床(上海知楚儀器)，薄層色譜硅膠板和200～300目柱色譜硅膠(青島海洋化工廠)，Sephadex LH-20(瑞典AIRTECH生物化學試劑公司)，YXQ-LS-18SI高壓蒸汽滅菌鍋(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)。其他試劑為國產分析純試劑(天津市大茂化學試劑廠，廣東環凱微生物科技有限公司)。

1.2 菌種及來源

發酵菌株：Streptomycessp.KIB-H1556分離自曼陀羅(DaturastramoniumL.)根際土壤，通過對其16S rRNA基因進行測序，發現其序列與Streptomycesgriseobrunneusstrain NBRC 12775的序列相似度是99.9%。菌株KIB-H1556保藏于昆明植物研究所植物化學與西部植物資源可持續利用國家重點實驗室。

測試菌株：番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、小麥赤霉病菌(Gibberellazeae)、玉米小斑病菌(HelminthosporiummaydisNisik & Miy)、棉花枯萎病菌(FusariumoxysporumSchl.f.sp.Vasinfectum)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum(Pass.) Leonard et Suggs)、水稻紋枯病菌(RhizoctoniasolaniKühn.)、玉米彎孢病菌(Curvularialunata(Walk) Boed)、黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.Cucumerinum)和大豆根腐病菌(Fusariumoxysporum)由西北農林科技大學馬亞團老師提供。菌株目前保藏于昆明植物研究所植物化學與西部植物資源可持續利用國家重點實驗室。

1.3 培養基及培養條件

固體培養基：為MS培養基，大豆粉20.0 g，加入1.0 L水，煮沸15 min，用紗布過濾除去濾渣，濾液定容到1.0 L，加甘露醇20.0 g，技術瓊脂粉20.0 g，pH = 7.0。

種子培養基：為TSB培養基，配方為大豆蛋白胨3.0 g/L，胰蛋白胨17.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，磷酸氫二鉀2.5 g/L，葡萄糖2.5 g/L，pH = 7.3 ± 0.2。

發酵培養基：可溶性淀粉10.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，甘油10.0 g/L，胰蛋白胨5.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，CaCO33.0 g/L，pH =7.0 ± 0.2。

PDA：200.0 g去皮土豆切碎，加入1.0 L水，煮沸30 min，用紗布過濾除去濾渣，濾液定容到1.0 L，加20.0 g葡萄糖，再加20.0 g瓊脂粉，攪拌溶解后滅菌待用。

將在MS平板上活化好的菌株接種到裝有50 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，置于28 ℃，220 rpm搖床上培養2天。將種子液按10%接種量轉接到盛有250 mL發酵培養基的1 L三角瓶中，共發酵20 L。置于28 ℃，220 rpm搖床上培養7天。

1.4 提取與分離

Streptomycessp.KIB-H1556發酵7天后，將發酵液于4 000 rpm下離心20 min。上清液用乙酸乙酯萃取3次；菌絲體用丙酮浸泡并超聲破碎后，蒸餾除去丙酮，剩余的水相用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相得萃取物5.3 g。該萃取物經硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯50∶1,10∶1,5∶1,1∶1,0∶1)分離，將石油醚-乙酸乙酯(1∶1，0∶1)部分合并得F組分:560 mg。F組分用甲醇溶解后再經過葡聚糖凝膠柱層析分離得到5個組分(F1-5)。F4組分用半制備HPLC分離(90%甲醇洗脫25 min)，富集4.58 min的流份得化合物 1(8.2 mg)，富集21.17 min的流份得化合物2(10.7 mg)，富集23.81 min的流份得化合物3(13.2 mg)。

1.5 活性測試

將九株測試菌分別接種至PDA培養基上活化培養，28 ℃避光培養4天，待其菌落基本長滿培養皿為止即可使用?；衔?、2、3、Carbendazim、Cycloheximide和Nystatin均配制成濃度為2.0 mg/mL的甲醇溶液備用。超凈條件下，在長滿菌落的培養皿中加入無菌水，用滅菌過的竹簽把孢子加到離心管中，加入30 mL滅菌后的PDA，翻轉搖至均勻后倒入培養皿中。待冷卻后，十字線標記。取無菌濾紙片(用打孔器將濾紙片加工成直徑為5 mm)，滴上5 μL樣品溶液，待溶劑揮干后移入已接菌的培養基平板上，培養皿中心到濾紙片中心的距離約為30 mm左右。將菌株放在28 ℃下培養24 h后觀察抑菌圈大小，用十字交叉法測量抑菌圈直徑。測試時以無菌水和甲醇為陰性對照，以Carbendazim、Cycloheximide和Nystatin為陽性對照，每塊平板中都需有陽性對照[6]。重復平行做3次，抑菌圈直徑測量3次求其平均值。

2 結果與分析

1.1 化合物結構鑒定

化合物1 白色粉末 (CH3OH)；分子式C35H56O8；ESI-MS:m/z627 [M+Na]+；1H NMR (600 MHz,CD3OD)δ:6.92 (1H,dd,J= 16.2,9.0 Hz,H-21),6.68 (1H,s,H-3),6.56 (1H,dd,J= 15.0,9.0 Hz,H-12),6.25 (1H,d,J= 16.2 Hz,H-20),5.87 (1H,br d,J= 9.0 Hz,H-5),5.78 (1H,d,J= 9.0 Hz,H-11),5.18 (1H,J= 15.0,9.0 Hz,H-13),5.15 (1H,dd,J= 9.15 Hz,H-15),3.94 (1H,dd,J= 7.2,16.2 Hz,H-14),3.80 (1H,m,H-17),3.63 (3H,s,2-OCH3),3.30 (1H,d,J= 6.6 Hz H-7),3.27 (1H,m,H-23),3.23 (3H,s,14-OCH3),3.11 (1H,m,H-18),2.42 (1H,m,H-22),2.07 (1H,dd,J= 14.4,12.0 Hz,H-16),2.00 (2H,m,H-9),1.97 (3H,s,H-26),1.83 (3H,s,H-29),1.60 (1H,m,H-24),1.10 (3H,d,J= 7.2 Hz,H-31),1.07 (3H,d,J= 7.2 Hz,H-27),1.05 (3H,d,J= 7.2 Hz,H-32),0.97 (3H,t,J= 7.2 Hz,H-30),0.93 (6H,m,H-25,H-33),0.90 (3H,d,J= 7.2 Hz,H-28);13C NMR (150 MHz,CD3OD)δ:167.2 (C-1),142.5 (C-2),60.6 (2-OCH3),134.4 (C-3),134.0 (C-4),145.1 (C-5),41.1 (C-6),81.2 (C-7),40.5 (C-8),41.4 (C-9),144.4 (C-10),125.6(C-11),133.0 (C-12),126.7 (C-13),85.1 (C-14),56.0 (14-OCH3),77.3 (C-15),38.7 (C-16),73.5 (C-17),47.4 (C-18),204.9 (C-19),130.0 (C-20),151.0 (C-21),42.6 (C-22),80.9 (C-23),32.6 (C-24),19.6 (C-25),14.0 (C-26),19.8 (C-27),22.9 (C-28),19.6 (C-29),11.3 (C-30),9.6 (C-31),17.8 (C-32)。 以上數據和文獻[7,8]報道一致，故鑒定為Bafilomycin D。

化合物2 黃色粉末(CH3OH);分子式C44H65NO13；ESI-MS:m/z838 [M+Na]+;1H NMR (600 MHz,CDCl3)δ:7.20 (1H,m,H-2′),6.89 (1H,d,J= 15.0 Hz,H-3′),6.67 (1H,s,H-3),6.49 (1H,dd,J= 15.0,10.8 Hz,H-12),5.81 (1H,d,J= 10.8 Hz,H-11),5.77 (1H,d,J= 9.0 Hz,H-5),5.16 (1H,dd,J= 15.0,9.6 Hz,H-13),4.95 (1H,d,J= 8.4 Hz,H-15),4.12 (1H,d,J= 10.8 Hz,H-17),3.88 (1H,t,J= 9.6 Hz,H-14),3.63 (3H,s,2-OCH3),3.61 (1H,m,H-21),3.29 (1H,d,J= 6.6 Hz,H-23),3.24 (3H,s,14-OCH3),2.61 (2H,m,H-8′),2.52 (1H,m,H-6),2.13 (1H,m,H-16),1.99 (3H,s,H-26),1.93 (3H,s,H-29),1.90 (2H,m,H-8),1.76 (1H,m,H-18),1.62 (1H,m,H-24),1.27 (1H,m,H-22),1.20 (2H,m,H-20),1.06 (3H,d,J= 7.2 Hz,H-27),1.05 (3H,d,J= 7.2 Hz,H-32),1.02 (3H,d,J= 7.2 Hz,H-31),0.92 (3H,d,J= 6.6 Hz,H-28),0.78 (6H,m,H-25,H-33),0.83 (3H,d,J= 6.6 Hz,H-30);13C NMR (150 MHz,CDCl3)δ:167.3 (C-1),141.2 (C-2),59.9 (2-OCH3),133.6 (C-3),133.3 (C-4),143.0 (C-5),37.1 (C-6),81.1 (C-7),40.0 (C-8),42.0 (C-9),142.8 (C-10),125.2 (C-11),133.4 (C-12),127.1 (C-13),82.2 (C-14),55.5 (14-OCH3),76.8 (C-15),36.6 (C-16),70.6 (C-17),41.2 (C-18),98.8 (C-19),39.9 (C-20),75.4 (C-21),38.1 (C-22),75.4 (C-23),27.8 (C-24),21.0 (C-25),14.0 (C-26),17.2 (C-27),21.6 (C-28),20.1 (C-29),9.8 (C-30),7.0 (C-31),12.2 (C-32),14.2 (C-33),164.2 (C-1′),133.1 (C-2′),133.2 (C-3′),163.7 (C-4′),114.9 (C-5′),175.6 (C-6′),26.2 (C-7′),32.6 (C-8′),198.1 (C-9′)。以上數據與文獻[9]報道一致，故鑒定為Bafilomycin B1。

化合物3 黃色粉末(CH3OH)；分子式C45H67NO13；ESI-MS:m/z852 [M+Na]+;1H NMR (600 MHz,CDCl3)δ:7.20 (1H,m,H-2′),6.89 (1H,d,J= 15.0 Hz,H-3′),6.63 (1H,s,H-3),6.48 (1H,dd,J= 15.0,10.8 Hz,H-12),5.81 (1H,d,J= 10.2 Hz,H-11),5.74 (1H,d,J= 9.0 Hz,H-5),5.18 (1H,dd,J= 15.0,9.6 Hz,H-13),5.07 (2H,m,H-15),3.88 (1H,t,J= 9.0 Hz,H-14),3.63 (3H,s,2-OCH3),3.60 (3H,s,19-OCH3),3.69 (3H,s,H-21),3.46 (1H,m,H-23),3.23 (3H,s,14-OCH3),2.61 (4H,m,H-8′),2.52 (1H,m,H-6),2.28 (1H,dd,J= 13.2,4.8 Hz),2.16 (1H,m,H-16),1.98 (3H,s,H-26),1.94 (3H,m,H-29),1.92 (2H,m,H-8),1.68 -1.60 (1H,m,H-18),1.06 (3H,d,J= 7.2 Hz,H-31),1.05 (3H,d,J= 7.2 Hz,H-32)1.04 (3H,d,J= 7.2 Hz,H-27),0.93 (3H,d,J= 6.0 Hz,H-28),0.83 (6H,H-25,H-33),0.78 (3H,d,J= 6.6 Hz,H-30);13C NMR (150 MHz,CDCl3)δ:166.6 (C-1),141.4 (C-2),60.2 (2-OCH3),133.4 (C-3),133.1 (C-4),142.7 (C-5),37.5 (C-6),81.2 (C-7),38.7 (C-8),41.2 (C-9),142.2 (C-10),125.3 (C-11),133.0 (C-12),127.4 (C-13),82.7 (C-14),55.5 (14-OCH3),76.8 (C-15),35.3 (C-16),69.4 (C-17),39.8 (C-18),102.8 (C-19),46.4 (19-OCH3),38.4 (C-20),75.1 (C-21),36.6 (C-22),76.9 (C-23),28.2 (C-24),21.7 (C-25),14.0 (C-26),17.3 (C-27),20.5 (C-28),20.0 (C-29),10.7 (C-30),7.4 (C-31),12.3 (C-32),14.1 (C-33),164.3 (C-1′),132.8 (C-2′),132.6 (C-3′),163.7 (C-4′),114.9 (C-5′),175.6 (C-6′),26.2 (C-7′),32.6 (C-8′),198.1 (C-9′)。 以上數據與文獻[10,11]報道一致，故鑒定為Bafilomycin B2。

1.2 化合物抑菌活性結果

通過對9株病原菌株的測試，發現化合物1對所測試病原菌均無活性，化合物2和3對多種植物病原菌具有抑制活性，包括玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、水稻紋枯病菌、玉米彎孢病菌和小麥赤霉病菌。相較于制霉菌素，化合物3對大豆根腐病菌的抑制活性略強(見表1)。

表1 化合物1～3抑菌圈直徑(mm)

注：表中數據均為3次重復平均值。

Note:Data given were from 3 duplicates.

3 討論

本文從鏈霉菌 KIB-H1556 菌株發酵液中分離得到3個化合物。其中Bafilomycin D通過抑制種子的萌發和生長而表現出除草活性[12]，Bafilomycin B1和Bafilomycin B2等類化合物對液泡(V型)H+-ATPase具有抑制作用[13]。Bafilomycins類化合物是從鏈霉菌中分離得到的16元二烯大環內酯抗生素，由于其具有生物活性，且含有不同的特征側鏈，這種獨特的大環內酯結構已被廣泛研究[14,15]。然而，在尋找新抗生素的同時，針對新的靶標，測試已知生物活性的代謝物對新靶標的生物活性，也顯示出有希望的結果[16]。因此，對這些大環內酯類抗生素進行多種病原體的活性測試，可以揭示其具有新的生物活性及潛在用途。本實驗首次發現化合物2和3具有廣譜抗真菌活性，尤其對玉米病原真菌的抑制活性顯著，為進一步研究開發抑制植物病害的生物農藥奠定一定的前期基礎。