壬基酚聚氧乙烯醚對斑馬魚精巢組織的影響

劉仁彬，姜錦林，張宇峰，梁霞，單正軍

1. 南京工業大學環境科學與工程學院，南京 210009 2. 國家環境保護農藥環境評價與污染控制重點實驗室，環境保護部南京環境科學研究所，南京 210042

壬基酚聚氧乙烯醚(nonylphenol ethoxylates, NPEO)由壬基酚(nonylphenol, NP)和環氧乙烷加合而成，是全球使用量第二大的商用非離子表面活性劑[1]。因其性能穩定、耐酸堿且價格低廉，被廣泛應用于洗滌劑、化妝品、紡織、造紙、印刷、農藥、制藥、冶金、石油、合成橡膠、塑料甚至食品等產品的加工和生產[2-4]。近些年來，全球NPEO的年產量大約70萬t[5]。隨著工業和農業的迅速發展，NPEO可以通過各種途徑釋放到環境中[6]。但在自然環境中，NPEO通常會降解成短鏈壬基酚聚氧乙烯醚、壬基酚和羧酸衍生物[7]。因此，這些降解產物經常會在廢水、地表水和沉積物中被檢測到[8]，NPEO及其降解產物對環境的潛在影響受到人們的廣泛關注。NP已被證實具有很強的雌激素活性，被稱為內分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals, EDCs)[9-10]。NPEO及其降解產物大量進入環境中，會對人體正常的激素分泌產生影響，造成致畸、致癌和致突變效應，還可以通過食物鏈在動物和人體內積聚。研究表明，EDCs可以通過與天然激素相結合、模仿天然激素作用等方式引起內分泌紊亂，對生物的發育和生殖產生影響，導致產卵量下降[11-12]。

截至目前，國內外已對NPEO降解產物NP開展了多項毒性效應研究，低濃度的NP能夠抑制虹鱒魚的生長發育[13]。NP作為一種環境雌激素，能與雌激素受體結合，促使魚類體內卵黃蛋白原(vitellogenin, VTG)的升高[14]。劉曉麗等[15]定量研究了NP對成熟雄性斑馬魚性腺細胞色素P450酶系表達的影響，發現NP可以通過抑制精巢中雄激素合成相關酶基因的表達影響精巢發育。但關于NPEO對魚類精巢組織結構影響的研究不多，NPEO對魚類性腺發育影響的機理還不是很清楚。因此，本實驗以成熟雄性斑馬魚(Daniorerio)為實驗材料，探究不同濃度NPEO暴露對受試魚性腺中類固醇激素受體基因(ERα和AR)以及細胞色素P450酶基因表達量的影響，觀察斑馬魚精巢組織結構的變化，深入探究NPEO對成熟雄性斑馬魚精巢組織結構影響的作用機制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑與儀器

試劑：壬基酚聚氧乙烯醚(分析純)購自阿拉丁化學公司，乙醇(分析純)和二甲苯(分析純)購自南京化學試劑有限公司，丙酮(分析純)購自上海凌峰化學試劑有限公司，17β-雌二醇(>99%)購自Sigma-Aldrich公司。

儀器：Leica DM4000 B顯微鏡，Bio-Rad Experion全自動電泳系統，Bio-Rad Gel DocTMXR+凝膠成像分析系統，Bio-Rad CFX96TMReal-Time System熒光定量PCR儀，Bio-Rad DNA Engine PCR儀。

1.2 實驗材料和試驗設計

斑馬魚購自南京大學模式生物研究中心，為性成熟雄性個體，平均體重(0.315±0.064) g，在環境保護部南京環境科學研究所斑馬魚實驗系統中心馴養2周以上，馴養魚用水為曝氣除氯后的自來水，每天定時投喂新鮮孵化的鹵蟲無節幼體(Artemianauplii)。

NPEO暴露設計：NPEO較難溶于水，需以丙酮作為助溶劑，配制成的母液濃度為500 mg·L-1(丙酮：5.0 mL·L-1)。設置5個試驗濃度組，分別為0.001、0.01、0.1、1.0和10.0 mg·L-1，設置雌二醇(E2：80.0 μg·L-1)試驗組、空白對照組和溶劑對照組。試驗在10 L(含8 L暴露液)的玻璃缸中進行，每個試驗組設3組平行，每組平行隨機放入試驗用魚30尾。采用半靜態水體暴露的方式進行試驗，試驗期間每天喂食3次，48 h更換一次暴露液，水溫控制在(25±2) ℃，光照周期14 h∶10 h，暴露周期為21 d。暴露21 d后取樣，取樣時將斑馬魚置于冰上，凍僵后迅速取精巢，立即放入液氮中速凍，放在-80 ℃冰箱中保存待用，精巢組織學研究的樣品用4%多聚甲醛固定待用。

1.3 斑馬魚精巢中相關基因的表達

采用高純總RNA快速抽提試劑盒(離心柱型)提取雄性斑馬魚性腺組織總RNA，取1L總RNA根據HiScriptTM1ST strand cDNA Synthesis kit的說明進行反轉錄，使用CFX96TMReal-Time System進行實時熒光定量PCR檢測，實時熒光定量PCR反應體系為20 μL，其中包括10 μL Faststart Universal SYBR Green Master，4 μL cDNA模板(反轉錄后按1∶10稀釋)，2 μL引物(6 mmol·L-1)，4 μL RNase-free water。反應條件如下：95 ℃ 10 min，1個循環；95 ℃ 10 s，55 ℃ 3 s，40個循環，4 ℃保存。3次重復實驗以減少誤差。通過分析反應后各引物的溶解曲線來檢測目標片段擴增產物、引物二聚體或DNA污染物情況。用1%凝膠電泳檢測目標片段擴增產物的長度(標準化內部參照)。

本研究選擇β-actin基因作為內參基因，檢測雌激素受體α(ERα)、雄激素受體(AR)以及細胞色素P450酶基因mRNA的相對表達量，基因名稱、引物序列及序列號見表1。

1.4 總RNA的檢測

將提取的斑馬魚性腺組織的總RNA進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示：可觀察到清晰的28S、18S和5S rRNA條帶，說明所提取的總RNA完整性較好，可繼續進行后續試驗。另外，用微量紫外分光光度計測定樣品在260 nm和280 nm的吸收值及OD260/OD280比值，測得比值介于1.8～2.0之間，因此可用于后續反轉錄實驗。

1.5 精巢組織石蠟切片

精巢組織學研究采用常規石蠟切片：取出固定好的精巢組織，經梯度乙醇(50%～100%)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成石蠟切片(厚5 μm)。切片樣本經二甲苯脫蠟和HE染色后，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 數據統計分析

采用2-ΔΔCt法進行相對基因表達量的計算。熒光實時定量得到的數據進行單因素方差分析(ANOVA)。所有實驗數據采用SPSS19.0統計軟件處理分析，利用方差分析檢驗實驗組和對照組之間的數據差異，用Tukey法檢驗計算P值，當P<0.05、P<0.01時認為差異顯著。

2 結果(Results)

2.1 NPEO對斑馬魚精巢性類固醇激素受體基因表達的影響

經過21 d的暴露，未觀察到斑馬魚出現死亡的情況。由圖1可知，不同濃度的NPEO暴露可以影響斑馬魚精巢中ERα和AR基因的相對表達量，與對照組相比，暴露于0.01和0.1 mg·L-1NPEO的斑馬魚精巢中ERα基因的表達量上調顯著(P<0.05)，10.0 mg·L-1NPEO處理組對斑馬魚精巢中ERα基因表達量的影響顯著(P<0.01)。僅10.0 mg·L-1的NPEO暴露顯著上調了斑馬魚精巢中AR基因的表達量(P<0.05)，其在低濃度NPEO的處理下沒有出現顯著性變化。

表1 基因名稱、引物序列和引物序列號Table 1 Gene name, sequence of the primers and accession number of primers

圖1 壬基酚聚氧乙烯醚(NPEO)對斑馬魚 精巢中ERα、AR基因表達的影響注：*P<0.05、**P<0.01，與對照組相比；CK、CP表示對照組和溶劑組。Fig. 1 Expression of ERα mRNA and AR mRNA in the testis of zebrafish exposed to nonylphenol ethoxylates (NPEO) Note: *P<0.05, **P<0.01, compared with the control; CK stands for control; CP stands for solvent control.

2.2 NPEO對斑馬魚精巢中細胞色素P450酶相關基因表達的影響

由圖2可知，斑馬魚精巢中CYP17基因的表達量與NPEO的濃度存在明顯的負劑量-效應關系，與對照組相比，在0.1 mg·L-1和10.0 mg·L-1NPEO的作用下，斑馬魚精巢中CYP17基因的表達量顯著下調(P<0.05)。在10.0 mg·L-1的NPEO暴露下，CYP19a基因的表達量最高，與對照組相比具有顯著性差異(P<0.05)。

2.3 NPEO對斑馬魚精巢影響的組織學觀察

如圖3a和圖3b所示，雄性斑馬魚性腺為正常發育的精巢組織，由許多生精小管(ST)和管間結構組成。精巢組織中可以看到精子(Sp)均勻分布于管腔中央及大小不一的生精小管中，每個生精小管內含有處于精原細胞(Sg)、初級精母細胞(PS)、次級精母細胞(SS)和精細胞(St)等不同發育時期的生精小囊。在本研究涉及的濃度范圍內，部分NPEO暴露組可導致成熟斑馬魚精巢組織結構的改變。與對照組相比，在NPEO暴露21 d后的斑馬魚精巢組織切片中可以看到，0.001 mg·L-1的NPEO暴露組未對斑馬魚精巢組織結構產生影響(圖3c)；0.01 mg·L-1NPEO處理組的斑馬魚精巢生精小管中處于精母細胞和精細胞時期的生精小囊數量減少，精子數量減少(圖3d)；0.1 mg·L-1NPEO處理組的斑馬魚生精小管管腔中精子密度增加，還出現了非細胞區域(圖3e)；1.0和10.0 mg·L-1NPEO處理組可見部分精子在生精小管管腔中央聚集，管腔內空隙明顯增大(圖3f和圖3g)。

圖2 NPEO對斑馬魚精巢中性激素合成 酶基因CYP17、CYP19a表達的影響Fig. 2 Effects of NPEO on the expression of steroidogenic genes CYP17, CYP19a in the testis of zebrafish

3 討論(Discussion)

研究結果顯示，在本研究所涉及到的NPEO濃度范圍內，1.0 mg·L-1以上的NPEO暴露對ERα、AR和CYP17、CYP19a基因表達量的影響與E2對這些基因的影響明顯一致。E2是一種典型的雌性激素，可以誘導雄性動物或未成熟的動物體內產生卵黃蛋白原，影響魚類的繁殖能力[16]，這顯示出NPEO暴露的類雌激素效應。

研究表明，E2會對小鼠精巢中CYP17基因的表達產生干擾，減少睪酮的合成[17]。在脊椎動物中，CYP17基因編碼的細胞色素P45017α-羥化酶是體內雄激素合成的限速酶，可以控制精巢中性激素的合成量，主要分布于腎上腺和性腺的間質細胞中[18]。在精巢中，P45017α-羥化酶將膽固醇轉化為睪酮[19]。本研究結果顯示，斑馬魚精巢中CYP17基因的表達量與NPEO的濃度存在明顯的負劑量-效應關系，10.0 mg·L-1的NPEO暴露能顯著下調斑馬魚精巢中CYP17基因的表達量。類似的影響在BPA暴露實驗中也存在，暴露于1 000 μg·L-1BPA的斑馬魚精巢中CYP17基因的表達量顯著下調，表現出顯著的負劑量-效應關系[20]。這說明斑馬魚精巢中睪酮的合成減少，性激素分泌能力下降。由此可以推斷，NPEO暴露抑制斑馬魚精巢中CYP17基因表達是一種擬雌激素效應。

魚類CYP19a基因編碼的P450芳香化酶(P450arom)是調控雌激素形成的關鍵酶，主要在卵巢中表達[21]，在雄魚精巢間質細胞中僅有少量的表達，合成的雌激素參與調控原始精原細胞的增殖[22]。魚類精巢中ERα和CYP19a基因的表達量是環境雌激素對精巢影響的生物標志物。研究結果顯示，NPEO暴露導致雄性斑馬魚精巢中CYP19a及ERα基因的表達量明顯增加。這說明，NPEO暴露能夠促進斑馬魚精巢中內源雌激素的合成，干擾斑馬魚精巢中原有性激素的平衡。以往的研究表明，NPEO是一種弱雌激素，NPEO進入環境后其EO鏈被打斷，形成保留1～2個EO的NP1EO和NP2EO，這些代謝物進一步氧化成相應的羧酸(NP1EC和NP2EC)，最終轉化為NP[23]。White等[24]證實4-壬基苯酚(NP)和4-壬基-苯氧基-雙氧乙烯醚(NP2EO)在虹鱒魚活體里具有一定雌激素活性，短鏈的NPEO在結構上與NP比較接近，表現出的雌激素活性也接近NP。Metcalfe等[25]觀察到100 μg·L-1的NP1EO和NP2EO混合暴露組導致一條雄性青鳉出現雌雄間性。在0.1 mg·L-1的NPEO作用下，斑馬魚精巢中ERα基因的相對表達量顯著上升，與NPEO的弱雌激素效應基本保持一致。而暴露于0.01 mg·L-1NPEO試液中的斑馬魚精巢中ERα基因的表達量也上調顯著，推測可能與其降解產物NP有關，例如Balch和Metcalfe[26]在NP1EO試液中檢測到降解產物NP存在，NP的存在也可能是促進斑馬魚精巢中內源雌激素合成的原因之一。NPEO進入生物體后能形成包括NP1EO、NP2EO和NP在內的多種相對穩定的代謝物[23]，因此，NPEO降解產物對斑馬魚精巢發育的可能影響同樣不容忽視，所以需要進一步研究它們之間聯合作用對斑馬魚的影響。以往的研究表明，ERα也可以通過正反饋調節來影響CYP19基因的表達[27]。因此，NPEO暴露對斑馬魚精巢中CYP19a基因表達量的影響也可能是ERα正反饋調節的結果。研究發現，BPA暴露可使金魚(Carassiusauratus)精巢中雄激素受體以及芳香化酶基因的表達量增加，BPA可以通過抗雄激素和雌激素雙重途徑減少金魚精子數量[28]。10.0 mg·L-1的NPEO暴露對斑馬魚精巢中AR基因的表達量有顯著影響，可以認為NPEO對雄性斑馬魚精巢發育的影響存在抗雄激素和雌激素雙重效應。

研究表明，高劑量E2暴露會使成熟雄魚精巢內精液量下降，精子密度增加，并且有可能導致不育[29]，本研究中E2處理組觀察到的結果與其保持一致。研究結果顯示，與對照組相比，在1.0和10.0 mg·L-1NPEO處理組的斑馬魚精巢組織切片中可見，部分精子集中在生精小管管腔中央，明顯增大了管腔內空隙。10.0 mg·L-1的NPEO暴露顯著上調了斑馬魚精巢中CYP19a基因的表達量，誘導內源性雌激素的合成。由此可見，NPEO可能通過內分泌干擾改變斑馬魚的精巢結構，在NPEO與內源雌激素的共同作用下，斑馬魚精巢生精小管內產生精子濃縮效應。因此，NPEO暴露會損傷斑馬魚成魚的精巢組織。

綜上所述，考察濃度范圍內，NPEO暴露可以導致性成熟的雄性斑馬魚精巢發育退化，NPEO暴露對雄性斑馬魚精巢發育的影響存在抗雄激素和雌激素雙重效應。NPEO作為一種弱雌激素，低濃度的NPEO(0.01 mg·L-1)通過降解產物NP對斑馬魚精巢中相關基因的表達產生影響，影響斑馬魚精巢結構。中高濃度的NPEO(≥0.1 mg·L-1)暴露通過抑制CYP17基因的表達干擾睪酮的合成；同時，NPEO暴露通過誘導CYP19a和ERα基因的表達增強雌激素效應，增加內源雌激素的合成，干擾斑馬魚精巢中原有的性激素平衡，最終導致斑馬魚成體精巢組織結構發生改變。需要注意的是，NPEO進入生物體后可以形成包括NP1EO、NP2EO和NP在內的多種代謝物，這些共存組分的雌激素效應影響也不應忽視。