2個甘蔗品種的遺傳基礎與核型分析

文明富，潘方胤，齊永文，吳嘉云，敖俊華，官錦燕，彭立沖，梁啟如，羅青文

(廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業研究所) 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室，廣東廣州，510316)

0 引言

甘蔗(Saccharumspp.)屬于單子葉植物綱(Monocotyledoneae)、禾本目(Graminales)、禾本科(Gramineae)甘蔗亞族中10屬之一[1]。分子細胞遺傳學研究表明，甘蔗是由多倍體原種熱帶種(Saccharum officinarum)作母本，多倍體野生種割手密種(Saccharum spontaneum)作父本經過一系列雜交形成的異源多倍體植物，其染色體有2n+n、n+n、n+2n、2n+2n等多種類型，且 n常常不是單倍體的原來數目，常有增減，即存在“不平衡”現象[2-4]。由于甘蔗染色體較小，數目多，種間差異大，染色體制片難度大，使得甘蔗核型分析較難，相關研究進展較慢。

一直以來，甘蔗的遺傳背景及遺傳方式都是育種工作者所關注的問題。Barbados報道[5]自1858年發現甘蔗可以結實，并在種內進行雜交育種開始，甘蔗育種發展史大概分為 5個階段[6]：(1)利用熱帶種選育時期；(2)利用“高貴化”過程選育高貴化品種時期；(3)利用高貴化品種培育雜交后代時期；(4)利用高貴化雜交后代選育現代品種時期；(5)拓寬品種遺傳組成源選育種時期?；仡?50多年的甘蔗育種史，突破性甘蔗新品種的育成，實則是一個不斷擴寬甘蔗遺傳組成源來選育新品種的過程[7]。當前生產栽培種大多含有甘蔗屬的熱帶種(Saccharum officinarum)、割手密種(Saccharum spontaneum)、印度種(Saccharum barberi)或中國種(Saccharum sinense)等 3種或以上的血緣[8-9]。隨著甘蔗現代育種技術的不斷進步，親本或原始育種材料的遺傳基礎已成為有效提高育種效率的關鍵。因此，分析選育甘蔗品種的遺傳組成、染色體組成系統演化和血緣構成的基本特征，在甘蔗育種上對正確選擇骨干親本或原始育種材料、提高育種效率具有重要意義。本研究以粵糖 06-233和粵糖 10-396為供試材料，通過遺傳基礎和染色體組型分析，探討和比較它們的細胞質源、遺傳組成源、染色體組成及類型分析，為今后甘蔗品種遺傳改良提供遺傳學和細胞學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種為廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業研究所)選育的粵糖 06-233和粵糖 10-396，其系譜圖見圖1?；浱?6-233于2016年5月通過全國農業技術推廣服務中心鑒定，該品種早熟、糖分高、高產穩產、農藝性狀好；粵糖10-396為選育的新品系，具有特早熟、宿根性強、糖分高等特性。

1.2 細胞資源和遺傳組成源分析

圖1 粵糖06-233和粵糖10-396系譜圖

供試甘蔗品種細胞質源分析以品種的母本追溯分析，直至查出原始母本，即細胞質源[10]。遺傳組成源的分析則以品種的父母本同時追溯分析，直至查出所含的全部基礎種質，即遺傳組成源，然后進行綜合確定。

1.3 染色體標本制備

選取成熟、健壯的粵糖 06-233和粵糖 10-396蔗莖切成雙芽莖段栽種于盛有河沙塑料桶中，澆水后放置于溫室中培養，待其長出干凈的根尖后，白天進行取樣。選取顏色嫩黃、分裂旺盛的根尖，在距根尖頂端0.5～0.8 cm處用鑷子掐斷，置于0.002 mol/L 8-羥基喹啉處理4 h，飽和對二甲苯處理2 h，轉入卡諾固定液(無水乙醇∶冰乙酸=3∶1)固定 24 h，70%乙醇4℃冰箱保存備用。

染色體標本制備采用酶解去壁低滲法進行處理[11-12]，即把處理的材料用蒸餾水清洗并浸泡于蒸餾水中30～60 min；再轉移到5%纖維素酶和4%果膠酶混合液中，放置于37℃恒溫酶解2～5 h；去除酶液，加入蒸餾水清洗并靜置于蒸餾水中低滲30～60 min；去除蒸餾水，滴加臨時配制的固定液(無水乙醇∶冰乙酸=3∶1)后固定15 min；在載玻片上先滴3滴固定液，夾取少量莖尖組織，并迅速涂抹在載玻片上，并在火焰上迅速烘烤置；用吉姆薩染色15 min，沖洗玻片干燥后鏡檢。

1.4 核型分析

用意大利Optika正立顯微鏡觀察，Optika Vision pro拍照系統拍照。每份材料選擇20個分散且形態較好的細胞進行染色體計數，選取5個染色體形態清晰且無重疊的中期細胞進行核型分析。之后測量其長度，根據染色體的形態特征以及對測量得到的數據進行分析，進行同源配對，排成核型圖。核型分析方法根據李懋學等[13]的標準，染色體形態依據Levan等[14]的方法歸類，核型對稱性按 Stebbins[15]的標準劃分。

臂比(r)=長臂(S)/短臂(L)·························(1)

染色體相對長度(%)=染色體長度/染色體組總度×100%·················································(2)

染色體相對長度指數(I.R.L)=染色體長度/全組染色體·····················································(3)

I.R.L＜0.76為短染色體(S)，0.76≤I.R.L≤1.00為中短染色體(M1)；1.01≤I.R.L≤1.25為中長染色體(M2)；I.R.L≥1.26為長染色體(L)。

平均長度核型不對稱系數(As.K.C，%)=長臂總長/全組染色體總長×100%···························(4)

2 結果與分析

2.1 細胞質源和遺傳組成源分析

通過追溯分析，2個甘蔗品種的細胞質源均為熱帶種班扎馬新黑潭(Bandjarmasin Hitam)(表1)，這跟我國早期引種有關，當初引進的大多數種質資源都為POJ2878或其姐妹系POJ2725的后代，POJ2878曾是世界上甘蔗雜交育種的最主要親本之一[16]，其細胞質來源于班扎馬新黑潭，而國內外選育的絕大部分品種都是POJ2878后代，表明班扎馬新黑潭可能是一個優秀的細胞質供體。

表1 粵糖06-233和粵糖10-396的細胞質源和基礎種質

2個甘蔗品種的遺傳組成是多源的，均含有割手密種、印度種、熱帶種和中國種的血緣(表1)。其中粵糖06-233的遺傳組成源數為16個，含量最多的是熱帶種，主要有班扎馬新黑潭(Bandjarmasin Hitam)、黑車里本(Black Cheribon)、卡路打不挺(K.Boothan)、路打士(Loethers)、拉海那(Lahaina)、斐濟(Fiji)、克里斯他林那(Crystalina)、灰毛里求斯(A.mauritius)、拔地拉(Badila)；其次是中國種，包括中國種(O. Tekcha)、中國種(品種名不詳)和夏威夷育巴(H. uba)；再次是割手密種，包含爪哇割手密(Glagah)和印度割手密(Co. spont)；含量最少的是高粱(Sorghum bicolor(L.) Moench)血緣。而粵糖10-396的遺傳組成源數為15個，由10個熱帶種、1個印度種、2個割手密種及2個中國種組成。一般來講，甘蔗品種的遺傳組成源越多，其性狀表現越優秀[16]。另外，研究表明，甘蔗品種的高糖源主要來自熱帶種[17]，親本所含熱帶種質數量越多，選育出的新品種糖分高的幾率越大?；浱?10-396和粵糖 06-233的熱帶種血緣分別為 10個和 9個，糖分檢測粵糖10-396比粵糖06-233高出近1個百分點。

2.2 核型分析

通過制片觀察研究，獲得了粵糖06-233和粵糖10-396的染色體數目，并對其進行了核型分析。染色體參數和核型特征見表 2，中期染色體、核型圖及核型模式見圖2～圖5。

2.2.1 核型組成分析

表2 粵糖06-233和粵糖10-396核型分析參數

一般來講，甘蔗不僅染色體數目多，就是同一品種在不同組織或不同生育期，觀察到的染色體數目也不盡相同[18]。2個供試材料染色體在數目上差異較大，在核型和染色體相對長度組成上也存在較大的差異?；浱?06-233的核型公式 K(2n)=88=82m+6sm，其中第3、9及第32對染色體為近中部著絲點染色體(sm)，其余為中部著絲點染色體(m)，具中部著絲粒染色體的百分比 93.18%。而粵糖10-396的核型公式K(2n)=106=2M+98m+6sm，其中第51對染色體為正中部著絲點染色體(M)，第39、40和42對染色體為近中部著絲點染色體(sm)，其余為中部著絲點染色體(m)，具中部著絲粒染色體的百分比94.34%。

2.2.2 染色體長短分析

由表2可知，粵糖06-233的染色體相對長度組成為14L+22M2+28M1+24S，粵糖10-396的染色體相對長度組成為18L+22M2+52M1+14S，2個品種染色體相對長度組成都含有長染色體(L)、中長染色體(M2)、中短染色體(M1)和短染色體(S)，相對長度組成差異不大，中長染色體(M2)和中短染色體(M1)占絕大部分，屬于較原始的核型類型；粵糖06-233的染色體相對長度大于粵糖 10-396相對長度；粵糖06-233和粵糖10-396這2個品種臂長大于2的染色體比例分別為4.54%和1.89%，最長與最短染色體的比值分別為4.33和4.3。

2.2.3 核型不對稱系數和核型類型分析

由表2可以看出，粵糖06-233的核型不對稱系數為56.31%，核型類型屬于2C型，而粵糖10-396的核型不對稱系數為57.77%，核型類型屬于1B型。一般來講，核型不對稱系數越小就越進化[19]，核型類型2C型的品種比1B型的品種更進化，因此粵糖06-233的進化程度高于粵糖10-396。

3 討論

圖2 粵糖06-233染色體中期分裂相和核型圖

圖3 粵糖10-396染色體中期分裂相和核型圖

圖4 粵糖06-233染色體核型模式圖

圖5 粵糖10-396染色體核型模式圖

從甘蔗育種發展歷程看，突破性甘蔗新品種的育成，需要通過不斷擴寬甘蔗遺傳組成源來實現[7]。當前生產栽培種大多含有甘蔗屬的熱帶種(Saccharumofficinarum)、割手密種(Saccharum spontaneum)、印度種(Saccharumbarberi)或中國種(Saccharum sinense)等3種以上的血緣，造成了遺傳基礎狹窄，甘蔗親本基因庫不夠豐富，長期以血緣相近的材料為親本進行雜交，造成后代異質性低，很難選育出有突破性的甘蔗新品種[8-9,20]。本實驗中粵糖 06-233和粵糖 10-396的遺傳組成源數量分別為16個和15個，主要含有熱帶種、割手密種、印度種和中國種血緣，遺傳基礎相對較窄。因此，需要不斷尋找可利用的新的種質資源，通過近遠緣雜交向甘蔗導入新種質，以拓寬現代甘蔗的遺傳基礎。蔗茅屬的斑茅(Saccharum arundinaceum Retz)[21]、蔗茅(Erianthus rufipilus (Steud.) Griseb)[22-23]、滇蔗茅(Erianthus rockii Keng)[24]為甘蔗的近緣屬植物，具有很多優異性狀，受到國內外的育種家重視。另外，河八王屬的河八王(Narenga porphyrocoma (Hance)Bor)是甘蔗近緣屬植物，具有耐旱、耐貧瘠、分蘗力強等優良性狀[25]。通過創新利用這些甘蔗近緣屬種質資源，拓寬甘蔗遺傳基礎，可培育更多突破性的甘蔗新品種。

植物染色體是遺傳信息的載體，控制遺傳變異，支配生長發育。核型分析主要通過研究其染色體數目及染色體形態特征來反映不同物種或品種之間存在的細胞學差異，不但能研究種間的遺傳變異、系統演化以及親緣關系，還可以為雜交育種選育以及雜種后代鑒定等提供理論依據。通過對粵糖06-233和粵糖10-396的核型分析結果可以看出，其染色體在數目上差異較大(分別是88條和106條)，具中部著絲粒染色體的比例分別為93.18%和94.34%，洪德元[26]認為著絲粒位于中部的染色體是最對稱的同時也是最原始的。植物染色體進化方向是由對稱向不對稱發展，具有中部著絲點的染色體的百分比越小和核型不對稱系數越大，則植物的染色體核型越不對稱，也越進化，因此，粵糖06-233進化程度高于粵糖 10-396。另外，Stebbins[19]將植物染色體核型按對稱性程度的高低分為12種類型(1A、2A、3A、4A；1B、2B、3B、4B；1C、2C、3C、4C)，認為核型對稱性程度越高的生物，其染色體變異越小，進化程度也越低；而非對稱性程度越高的生物，其染色體變異越大，進化程度越高?；浱?6-233和粵糖10-396這2個品種核型分類屬于2C型和1B型，表明粵糖06-233進化程度高于粵糖10-396。