海南地區健康青年腸道中乳酸菌和雙歧桿菌多樣性研究

溫永平 沈玲玲 孫志宏 江正強*

（1 中國農業大學食品科學與營養工程學院 北京100083 2 內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室農業農村部奶制品加工重點實驗室 呼和浩特010018）

腸道菌群占據人體微生物的絕大部分，這些微生物所包含的基因更是人類自身基因數量的100 倍以上[1]。腸道菌群組成和變化與人體健康及眾多疾病的發生、發展密切相關。乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB） 和雙歧桿菌（Bifidobacterium，B.）是人體腸道中最為常見的益生菌，其中部分菌種已被多個監管機構賦予了“公認為安全”（Generally Recognized As Safe，GRAS）的地位[2-3]，在食品工業、畜牧行業及醫療衛生領域具有廣泛應用。

乳酸菌指發酵糖類主要產物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱[4]。依據該定義，目前共有超過40 多個細菌屬可以劃歸為乳酸菌[5]，常見的菌屬包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、片球菌屬（Pediococcus）、明串珠菌屬 （Leuconostoc） 和鏈球菌屬（Streptococcus）等。乳酸菌可以通過多種機制阻止病原體在腸黏膜組織的粘附和繁殖，緩解腸道不良反應癥狀，并能將各種酶釋放到腸道中，協同宿主消化[6]。而雙歧桿菌屬細菌具有保護腸道屏障功能的作用，增加雙歧桿菌能降低非選擇性腸道通透性，防止抗原/毒素從腸道進入宿主循環系統[7]。此外，乳酸菌和雙歧桿菌通過產生可被其它腸道微生物利用的胞外多糖，有助于維持腸道微生物群落的穩定性[8]。

近年來，DNA 測序能力的提高及測序成本下降，為研究人員解析各類樣品中微生物組成及宏基因組功能變化提供了有利條件。16S rRNA 基因擴增子測序被廣泛用于評估樣品中優勢細菌和古細菌群落組成，包括人類微生物組計劃（Human Microbiome Project）[9]、地球微生物計劃（Earth Microbiome Project）[10]、塔拉海洋項目（Tara Oceans project）[11]等均通過將測序得到的細菌16S rRNA與參考數據庫如Sliva、Greengene 比對獲得樣品中優勢菌群組成。然而，乳酸菌和雙歧桿菌在人體腸道中的相對含量往往較低，細菌16S 通用引物很難準確揭示這部分菌群的組成。鑒于此，本研究將乳酸菌特異性引物和雙歧桿菌特異性引物擴增與PacBio SMRT 測序技術相結合，從種的水平探討27 名海南地區健康青年腸道中乳酸菌和雙歧桿菌的豐度和生物多樣性，以期更為準確地揭示健康青年腸道中這兩類菌群的豐度和多樣性，并為后續研究提供有益參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗志愿者信息及樣品收集 本研究共征集了27 名我國海南?？诘貐^健康志愿者，詳見表1。所有志愿者均為海南大學在校學生，身體質量指數小于30 kg/m2，并且在試驗前6 個月未攝入抗生素。

1.1.2 主要試劑 MO BIO Power Fecal R DNA Isola tion Kit 試劑盒，美國Mo Bio 公司；Taq DNA 聚合酶、dNTP mix、10x Easy Taq Buffer 等PCR 體系試劑，大連寶生物工程有限公司；5×TBE電泳緩沖液 （Tris 堿 54 g、Na2EDTA·2H2O 3.72 g、硼酸27.5 g，定容1 000 mL，pH 8.0），1.0%的瓊脂糖膠（1.0 g 瓊脂糖溶于100 mL 0.5×TBE 緩沖液），天津基準化學試劑公司。

表1 志愿者信息Table 1 The information of volunteers

1.1.3 主要儀器、設備 PacBio SMRT RS II 測序平臺，美國Pacific Biosciences 公司；Applied Biosystems PCR 儀，美國應用生物系統公司；ND-1000 型微量紫外分光光度計，美國賽默飛科技公司；CDS8000 型UPV 凝膠成像分析系統，上海賽智創業科學公司；HWS24 型恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；Eppendorf 5810R 高速冷凍離心機，德國艾本德公司；Qubit 2.0，美國生命技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 所有樣品采集均由志愿者個人完成，用實驗室提供的無酶、無菌管采集約15 g的新鮮糞便樣品，樣品采集后立即加入15 mL 的保護劑，迅速冷凍，并盡快運回實驗室，存放在-80℃冰箱內備用。

1.2.2 糞便細菌宏基因組DNA 提取 取0.3 g 充分混勻的糞便樣品，采用Power FecalRDNA Isolation Kit 試劑盒，依照說明書的提取步驟抽提樣品中細菌宏基因組DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計檢驗DNA 樣品的完整度、純度及濃度。上述3 個條件都滿足后續試驗要求的DNA 樣品暫存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.3 乳酸菌和雙歧桿菌目的片段擴增、建庫及測序 本研究用乳酸菌和雙歧桿菌引物以及建庫測序方法參考文獻[12]。具體而言，乳酸菌引物為Lab-6F （5′-GCTCAGGAYGAACGCYGG-3′）和Lab-6R （5′-CACCGCTACACATGRADTTC-3′）；雙歧桿菌引物為Bif-6F（5′-GGTAAGAGTCGGACGCTGTGCAATAA-3′）和Bif-6R （5′-GAAAGAAGAAGGCCACCAAGTAA-3′）。PCR 擴增程序設置為：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性30 s，60℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共循環28 次；72℃終端延伸7 min，4 ℃終止。各樣品的PCR 產物經AMPure beads 純化后用PacBio SMRT II 測序平臺配套試劑盒構建文庫，根據廠商提供的說明書按如下步驟操作。

1.2.4 高質量序列的提取 使用SMRTRPortal 對原始序列進行質控，乳酸菌質控條件：①插入片段重復測序的次數≥5；②最小預測精確度為90%；③最短插入序列長度為650 bp；④最長序列長度為850 bp。對雙歧桿菌的質控條件有所調整，將最小插入片段長度和最大插入片段長度分別設置為600 bp 和800 bp，其它質控條件相同。

1.2.5 生物信息學分析 下機數據的生物信息學處理基于QIIME（V1.7）平臺完成，具體分析流程參考Hou 等[13]的方法。其中乳酸菌注釋使用Greengenes（v13.8）、RDP （v11.5）和Silva（v128）3 個數據庫，雙歧桿菌注釋使用從不同雙歧桿菌菌種提取得到的rpsK 基因數據庫。

1.2.6 數據處理 使用R 語言“ggplot2”包對QIIME 得到的結果進行數據可視化。使用“vegan”包中的anosim 函數進行多元方差分析（Permutational multivariate analysis of variance，Permanova），計算影響志愿者腸道乳酸菌和雙歧桿菌的主要因素。使用Wilcoxon 秩和檢驗、Kruskal-Wallis 多組檢驗比較兩組和多組樣品間指標差異。采用LefSe（Linear discriminant analysis effect size） 比較不同分組間存在顯著差異的菌群。使用Spearman 相關性展示乳酸菌和雙歧桿菌之間的相關關系。

2 結果

2.1 志愿者腸道中乳酸菌組成

2.1.1 測序量評估 所有樣品原始下機數據量為70 535 條，經QIIME 初步處理后發現其中屬于乳酸菌的序列為14 630 條（20.74%）。通過內部腳本提取這部分序列用于后續各樣品乳酸菌多樣性分析。稀疏曲線（圖1a）和香農曲線（圖1b）結果顯示，雖然各樣品中乳酸菌的最終測序量均未超過1 600 條序列，且稀疏曲線也未達到最終的水平狀態，但大部分樣品香農曲線均已達到水平狀態。這表明隨著測序量的增加，有可能檢測到樣品中更多的乳酸菌種系型。當前的測序量足以揭示樣品中主要乳酸菌的組成。

在此基礎上，進一步評估性別、年齡和BMI對志愿者腸道中乳酸菌豐度和多樣性的影響。首先，按照WHO 基于BMI 值劃分的亞洲人肥胖參考標準將所有志愿者進行分組，分別為BMI＜18.5偏瘦（Lean）、18.5＜BMI≤24.9 之間正常（Normal）、BMI≥25 肥胖（Obesity）[14]。結果發現男性腸道中乳酸菌豐度和多樣性指標均顯著高于女性 （圖1c、1d、1e 和1f），而年齡和BMI 對此無顯著影響（P＞0.05）。

圖1 各樣品測序量評估及腸道中乳酸菌的α 多樣性比較Fig.1 Evaluation of sequencing quantity of each sample and comparison of gut LAB’s α diversity

2.1.2 志愿者腸道中乳酸菌組成 在屬的水平，從所有志愿者腸道共鑒定到10 個乳酸菌屬，平均相對含量在1%以上的菌屬有6 個（圖2a），主要包括鏈球菌屬（58.41%）、乳桿菌屬（23.87%）、魏斯氏菌屬（Weissella，7.31%）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus，5.08%）、乳球菌屬（2.48%）和腸球菌屬（Enterococcus，1.86%）。此外，還鑒定到部分相對含量在1%以下的乳酸菌屬，包括明串珠菌屬（0.63%）、肉食桿菌屬（Carnobacterium，0.12%）、毛螺菌屬（Lachnospira，0.07%）和葡萄球菌屬（Staphylococcus，0.05%）。由圖2a 可知，不同個體腸道菌群中乳酸菌的組成及相對含量存在較大差異，整體上男性和女性乳酸菌菌群組成較為相似（圖2b）。隨著年齡的增加，魏斯氏菌屬的平均相對含量出現上升趨勢，其它菌屬未發現規律性改變。此外，隨著BMI 的降低，亦未發現規律性變化的乳酸菌屬。

在種的水平上，從所有志愿者的樣本中共發現86 個乳酸菌種，平均每名志愿者腸道乳酸菌菌種的數目為19 個。所有樣品中，平均相對含量在1%以上的共有11 個菌種（圖3a），主要包括唾液鏈球菌（Streptococcus salivarius，34.33%）、德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii，12.17%）、溶血性鏈球菌（Streptococcus gallolyticus，7.31%）、融合乳桿菌 （Weissella confusa，6.01%）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus，5.54%）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei，3.78%）、嬰兒鏈球菌（Streptococcus infantarius，3.69% ）、Ruminococcus faecis（2.35%）、副溶血鏈球菌（Streptococcus parasanguinis，2.12%）、乳酸乳球菌（Lactococcus garvieae，1.22%）和嬰兒鏈球菌（Streptococcus infantis，1.10%）。由圖3b 可知，不同年齡或BMI 的志愿者腸道乳酸菌種變化非常大，尚未發現規律性變化的乳酸菌種。值得注意的是，樣本HN10 和HN11 腸道中德氏乳桿菌所占比例非常高，通過隨后的回訪發現，這兩名志愿者平時均有飲用酸奶的習慣。

圖2 志愿者腸道乳酸菌在屬水平的組成Fig.2 Genus-level composition of LAB in the gut of volunteers

圖3 志愿者腸道乳酸菌在種水平的組成Fig.3 Species-level composition of LAB in the gut of volunteers

2.1.3 志愿者腸道乳酸菌群腸型（Enterotyping）分析 根據志愿者腸道乳酸菌在種水平的組成進行腸型分析，結果顯示所有志愿者可分為兩個腸型（圖4）。腸型Ⅰ（15 人）和腸型Ⅱ（12 人）人群主要由唾液鏈球菌組成，然而該菌在兩個腸型人群中所占比例顯著不同（P＜0.05）。具體而言，腸型Ⅰ人群腸道優勢乳酸菌為唾液鏈球菌（18.96%）、德氏乳桿菌（16.70%）和S.gallolyticus（13.13%）；腸型Ⅱ人群優勢乳酸菌為唾液鏈球菌（53.55%）、德氏乳桿菌（6.15%）和嬰兒鏈球菌（4.69%）。兩個腸型的人群組成與性別、BMI 和年齡之間沒有明顯關系。

圖4 志愿者腸道乳酸菌種水平腸型分析Fig.4 Enterotyping analysis of gut LAB from volunteers at the species level

2.1.4 志愿者腸道乳酸菌群落結構的比較分析基于非加權UniFrac 距離的主坐標分析，可顯示不同分組個體腸道乳酸菌菌群構成的差異。通過Premanova 分析統計各分組是否對志愿者腸道乳酸菌菌群產生影響。分析結果顯示，年齡因素是造成不同志愿者腸道乳酸菌種類差異的主要原因（F=1.42，P=0.03），而性別（F=1.24，P=0.113）和BMI（F=1.16，P=0.119）對此沒有顯著影響。

基于不同分組進行LefSe 分析，發現乳酸乳球菌在21 歲志愿者腸道中的相對含量顯著高于20歲的志愿者；與之相反，德氏乳桿菌則在20 歲志愿者腸道中的含量更高，其它分組中未發現存在顯著差異的菌種。

2.2 志愿者腸道中雙歧桿菌組成

2.2.1 測序量評估 從27 份樣本共獲得雙歧桿菌測序序列81596 條，經OTU 劃分，共得到OTU 9 745 個，平均每個樣品得到的OTU 數目為581個（360～875，SD=139.4）（表2）。經Wilcoxon 秩和檢驗、Kruskal-Wallis 多組檢驗，所有分組α 多樣性指數均無顯著差異，說明志愿者腸道中雙歧桿菌的豐度和多樣性與志愿者年齡、性別和BMI 指數不相關。

2.2.2 志愿者腸道中雙歧桿菌的組成 從所有志愿者測序數據中共鑒定到9 個雙歧桿菌種，平均相對含量在0.5%以上的共有5 個，結果如圖5所示。主要菌種包括鏈狀雙歧桿菌（B.catenulatum，40.05%）、長雙歧桿菌（B.longum，37.12%）、糞雙歧桿菌（B.stercoris，24.70%）、兩歧雙歧桿菌（B.bifidum，6.11%）和青春雙歧桿菌（B.adolescentis，0.53%）。其余含量較低的雙歧桿菌還包括動物雙歧桿菌 （B.animalis，0.34%）、短雙歧桿菌（B.breve，0.27%）、B.kashiwanohense（0.18%）和齒雙歧桿菌（B.dentium，0.16%）。

基于圖5發現了一個很有意思的現象，所有樣本以加權UniFrac 距離進行UPGMA（unweighted pair-group method with arithmetic means）聚類時，樣品可以分為3 個類群，各類群的代表性菌種分別為鏈狀雙歧桿菌、糞雙歧桿菌和長雙歧桿菌。

表2 所有樣本中雙歧桿菌測序量和α 多樣性指數Table 2 Sequencing depth and α diversity index of Bifidobacterium in all samples

為了進一步驗證性別、BMI 和年齡對志愿者腸道雙歧桿菌可能的影響，對3 組樣本進行差異顯著性檢驗，結果顯示：男性志愿者腸道中B.kashiwanohense 的相對含量顯著高于女性（P=0.02）。此外，動物雙歧桿菌、鏈狀雙歧桿菌和B.kashiwanohense 在肥胖人群中的相對含量顯著高于正常人群（P＜0.05），而年齡與雙歧桿菌的組成之間沒有明顯關系。本研究還發現糞雙歧桿菌和長雙歧桿菌主要在女性志愿者腸道中出現，長雙歧桿菌含量較高的個體全部屬于BMI 正常的志愿者。

2.3 志愿者腸道中乳酸菌和雙歧桿菌相關性分析

為了揭示腸道中乳酸菌之間、雙歧桿菌之間以及乳酸菌和雙歧桿菌之間的相關關系，對樣品中的主要乳酸菌和雙歧桿菌進行Spearman 相關性分析，結果如圖6所示。在乳酸菌屬的水平上，鏈球菌屬與乳桿菌屬極顯著負相關（P＜0.001），與瘤胃球菌屬顯著負相關（P＜0.05）。在乳酸菌種的水平上，德氏乳桿菌與食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）、乳酸乳球菌顯著正相關（P＜0.05）。雙歧桿菌菌種方面，B.kashiwanohense 和鏈狀雙歧桿菌極顯著正相關（P<0.001），與長雙歧桿菌顯著負相關（P<0.05）；鏈狀雙歧桿菌和糞雙歧桿菌、長雙歧桿菌極顯著負相關（P<0.01）。糞雙歧桿菌與兩歧雙歧桿菌顯著正相關（P<0.05）。乳酸菌種和雙歧桿菌菌種相關性方面，僅有德氏乳桿菌和B.kashiwanohense 顯著正相關（P<0.05）。

圖5 志愿者腸道雙歧桿菌相對含量Fig.5 The relative abundance of Bifidobacterium in gut of volunteers

圖6 志愿者腸道乳酸菌和雙歧桿菌的相關性Fig.6 Spearman’s rank correlation between LAB and Bifidobacterium in the gut of volunteers.

3 討論

乳酸菌和雙歧桿菌是人體腸道的代表性益生菌群，然而這兩類菌在成年人體內的相對含量均比較低[15]，基于16S 通用引物很難揭示這部分菌群的組成。之前，Zhang 等[16]使用熒光定量PCR（qPCR） 對糞便樣品中的部分乳酸菌屬和雙歧桿菌屬進行定量分析，也僅從屬的水平分析部分菌屬的含量。此外，qPCR 分析受限于不同菌群的特異性引物，試驗和分析過程耗時費力。本研究基于乳酸菌和雙歧桿菌特異性引物對糞便樣本中上述菌群進行擴增，同時利用三代測序的長讀長優勢，準確揭示海南地區青年人群糞便樣本中乳酸菌和雙歧桿菌的多樣性構成。

本研究在所有志愿者腸道中共檢測到86 種乳酸菌種和9 個雙歧桿菌種，遠大于常規16S 測序所能檢測到或qPCR 所能定量到的乳酸菌和雙歧桿菌數量。不同志愿者腸道中乳酸菌和雙歧桿菌組成存在較大差別，這可能與每個人平時的飲食習慣等直接相關，這是因為隨訪時發現，在腸道中德氏乳桿菌相對含量較高的HN10 和HN11，平時均有飲用酸奶的習慣。之前有研究表明：性別、年齡和BMI 是影響人體腸道菌群組成的重要因素[17-18]。本研究亦分析了上述因素與青年人群腸道中乳酸菌和雙歧桿菌的關系，結果發現雖然男性志愿者腸道乳酸菌豐度和多樣性指數均顯著高于女性，但基于非加權UniFrac 距離的主坐標分析卻顯示兩組志愿者沒有顯著差異，這說明在乳酸菌的種類上男、女之間并沒有顯著差異，然而男性中各類乳酸菌相對含量分布更為均勻，且豐度也更高。這與Yoshio Suzuki[19]基于酸奶消費對青年人群腸道菌群影響男女有別的研究結果類似。造成該結果的原因可能與男性和女性發育成熟速度有一定關系，需進一步驗證。本研究顯示：年齡是影響志愿者腸道中乳酸菌多樣性的重要因素，然而納入這項研究的所有志愿者年齡差別并不大（21～24 歲）。通過回訪這些志愿者發現，不同年齡段志愿者在海南大學所處的學習階段不同，低年齡段的志愿者主要在學校學習理論知識，飲食、作息等均為典型的校園生活模式，而高年齡段的很多學生已經開始進行課外實習，長期在外奔波，飲食、作息均與在校時發生了較大改變，這些均會對腸道菌群及乳酸菌構成帶來顯著影響[20-21]。

乳酸菌種水平的腸型分析顯示，兩個腸型的代表菌種均為唾液鏈球菌，盡管該菌在兩個腸型人群中的比例存在顯著差異。唾液鏈球菌是出生后人類口腔和腸道的首批定殖者之一，該菌也定植在胃和空腸中，其對于口腔和消化道生態起著重要作用[22]。此外，還有研究表明，唾液鏈球菌能夠通過抑制病原體激活的炎癥途徑影響免疫反應，這表明其在調節人類上皮細胞免疫反應中發揮了重要作用[23-24]。Ghalia 等[25]研究發現，從口腔分離的唾液鏈球菌能夠在體外和體內預防炎癥反應。根據腸道中優勢菌群雙歧桿菌的不同，可以將志愿者分為以鏈狀雙歧桿菌、長雙歧桿菌、糞雙歧桿菌為優勢菌的3 個類群，性別和BMI 均會對雙歧桿菌組成產生影響。Kerckhoffs 等[26]研究發現，與健康人相比，鏈狀雙歧桿菌計數在腸易激綜合征患者十二指腸黏膜顯著下降。之前的研究發現長雙歧桿菌部分亞種可以利用多種不同的寡糖，使其在與其它腸道菌群的競爭中占據優勢[27]，其還可以分泌一種小聚糖或糖脂，通過下調各種胎兒細胞培養模型中的TLR4 和驗證信號來預防上皮炎癥反應[28]。使用長雙歧桿菌制備的發酵豆奶處理人腸上皮細胞系HT-29，可以有效降低TNF-α 誘導的IL-8 的產生[29]；長雙歧桿菌對于結腸癌的發生亦有抑制作用[30]。糞雙歧桿菌是2010年從健康青年腸道中分離得到[31]，目前對于該菌益生作用的研究較少?；谀壳暗难芯拷Y果，志愿者腸道中優勢的乳酸菌和雙歧桿菌多具有一定的益生功效，這對維持人體健康十分重要。本研究基于乳酸菌和雙歧桿菌在不同志愿者腸道中的組成進行相關性分析，發現無論是乳酸菌之間、雙歧桿菌之間亦或是乳酸菌和雙歧桿菌之間均有部分菌群存在顯著相關關系，菌群間的相互平衡和制約是腸道菌群維持穩定的原因之一。

4 結論

海南地區青年人群腸道中擁有豐富的乳酸菌和雙歧桿菌，其中乳酸菌主要由唾液鏈球菌、德氏乳桿菌、溶血性鏈球菌、融合乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等組成，雙歧桿菌主要由鏈狀雙歧桿菌、長雙歧桿菌、糞雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌組成。飲食習慣和性別以及性別和BMI 分別是腸道乳酸菌和雙歧桿菌組成的重要影響因素。腸道中優勢乳酸菌和雙歧桿菌對人體健康發揮重要作用，而一些新分離鑒定菌種的益生功效還需后續研究揭示。本研究所采用的PacBio SMRT 三代測序技術結合特異性引物的方法在種水平揭示了腸道中特定菌群的組成，這對后續研究的開展具有很好的指導意義。