培養條件對保加利亞乳桿菌中胞外肽酶PrtB基因表達的影響

盧佳音 李東飛 趙悅含 侯俊財

（東北農業大學食品學院 哈爾濱150030）

乳酸菌菌體在生長過程中，培養環境中的肽和游離氨基酸很快被消耗[1]。當乳酸菌在發酵與生長時，通常存在許多大分子蛋白質及一些無機氮源，然而這些都不能被乳酸菌直接利用，通常情況下，乳酸菌將這些大分子的蛋白質分解掉，補充其自身生長所需的氨基酸[2]。通常由3 部分構成乳酸菌的水解體系：將細胞外的蛋白質水解成多肽的胞外蛋白酶；轉移系統將胞外水解產物轉運至胞內；胞內肽酶將轉運到細胞的水解產物進一步水解為游離氨基酸，在細胞內的一些物質代謝與蛋白質的合成反應中，都會有它們的參與[3]。根據研究顯示，有3 種基因是乳酸菌常見的，分別為PrtB、PrtP 和PrtS，而保加利亞乳桿菌為PrtB，乳酸乳球菌為PrtP，嗜熱鏈球菌為PrtS[4]。相對于其它乳酸菌，有關保加利亞乳桿菌的蛋白水解酶的基因表達研究相對較少[5]，尤其國內少有報道。以RT-PCR 技術作為主要的檢測方法，通過設置不同培養條件，探究保加利亞乳桿菌中PrtB 基因的表達變化規律。

1 材料與方法

1.1 菌株和試劑

菌株：德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus debreuckii ssp.bulgaricus）LB08006、LB08007、LB08012、LB08014、LB08015、LB08016、LB08017，由東北農業大學乳品科學教育部重點試驗室分離保存。

主要試劑：EDTA·2Na，Amresco；DEPC，科爾生物有限公司；RNAprep pure 培養細菌總RNA提取試劑盒，天根生化科技北京有限公司；Primer-ScriptRRT 反轉錄試劑盒，寶生物大連工程有限公司；SYBRRPremix Ex TaqTM試劑盒，寶生物大連工程有限公司。

1.2 菌株生長曲線的測定

將菌株活化后連續傳代培養，在42 ℃培養條件下，每2 h 取出2 mL 培養液，調節波長為OD600，測定其吸光值[6]。

1.3 基因表達的檢測方法

根據課題目的（在轉錄水平上探討乳酸菌不同樣本之間關鍵酶PrtB 基因的表達變化規律），主要采用RT-PCR 手段進行研究。

1.4 關鍵酶基因及管家基因的確定

根據參考文獻[7]至[11]中所示方法確關鍵酶基因及管家基因定。

其目的基因見表1。

表1 實時定量PCR 的目的基因Table 1 Target genes for real-time qPCR

1.5 實時熒光定量PCR 引物設計與合成

用16s rRNA 作管家基因[12]，根據GenBank提供的德氏乳桿菌保加利亞亞種ATCC 11842 的DNA 序列（GenBank accession number：NC_ 008054.1）中相應基因的序列，采用primer5.0 軟件設計基因引物，如表2所示。

表2 實時熒光定量PCR 引物Table 2 The primer of real-time RT-PCR

1.6 RNA 的提取

根據RNAprep pure 試劑盒法，其提取步驟按照說明書。

1.7 反轉錄合成cDNA

反轉錄合成cDNA 參照杜越歐等[13]的方法，利用PrimerScriptR RT 反轉錄試劑盒 （日本Takara Biotechnology），其提取步驟按照說明書。

1.8 實時熒光定量PCR

使用Takara 公司的SYBRRPremix Ex TaqTM試劑盒配制PCR 反應液，反應體系為：SYBRRPremix Ex TaqTM（2×）10 μL；上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL；ROX Reference Dye II（50×）0.4 μL；dH2O（滅菌蒸餾水）6.8 μL，稀釋cDNA 為原樣品的10 倍，取樣品2 μL；總體系為20 μL[13]。

使用ABI 7500 實時熒光定量PCR 儀進行實時熒光定量PCR 試驗，不同反應體系樣品做3 個重復。通過兩步法PCR 擴增標準程序：預變性的條件：95 ℃30 s；PCR 反應：95 ℃5 s，60 ℃34 s，40 循環。

1.9 試驗設計方案

1.9.1 不同生長階段對胞外肽酶PrtB 基因表達的影響 活化好試驗用菌，通過測定其生長曲線來選擇本試驗用菌種。分別在6，12，18 h 與24 h提取發酵液，再提取菌體RNA。

1.9.2 不同氮源對胞外肽酶PrtB 基因表達的影響 采用液體MRS 培養基、無氮液體MRS 培養基與含酪蛋白胨液體MRS 培養基，將試驗用菌接入其中，調整pH 6.2，42 ℃，12 h。

1.9.3 不同初始pH 對胞外肽酶PrtB 基因表達的影響 7 株保加利亞乳桿菌經活化分別接種于初始pH 5.6，5.9，6.2，6.5 的液體MRS 培養基中，42℃，12 h。

1.9.4 不同溫度對胞外肽酶PrtB 基因表達的影響 將恒溫水浴鍋溫度的設置為30，37，42 ℃和45 ℃，在pH 6.2 條件下發酵12 h。

首先提取RNA，隨后測定其濃度與完整性，再將其反轉錄為cDNA，最后通過RT-PCR 檢測。

1.10 實時熒光定量PCR 數據處理分析

分析基因CT 值，求得標化后的-△△CT 值，通過2-△△CT 法評估目的基因的相對表達量[14]。用SPSS（11.5）軟件進行方差和雙因素試驗分析。

2 結果與分析

相對于其它方法，RT-PCR 具有更高的靈敏性與準確性，鑒別乳酸菌的菌種與其基因差異更加普遍[7，15-16]。

2.1 RNA 的數量和質量

RNA 的數量與質量決定了后續試驗能否成功，其中，總RNA 的數量是反轉率效率的關鍵點。圖1中，23S 與16S 均能被清晰觀察到，此結果說明RNA 有很小程度的降解。

基因組DNA 可被試劑盒提供的DNA 酶（DNase I） 高效提取。在這種條件下能有效預防RNA 樣品被基因組DNA 污染，發生非特異性擴增，導致RNA 的表達量高于實際量。本試驗提取的RNA 樣品經檢測，可用于后續實時熒光定量PCR 試驗。

圖1 RNA 樣品電泳圖Fig.1 Electrophoresis of RNA

利用反轉錄法將得到的RNA 轉變為cDNA，通過PCR 試驗，根據條帶的大小與目的基因作對比，由此可以確定二者的相似度。若沒有出現雜條帶，且在適宜的亮度區間內，則證明通過反轉率合成的cDNA 無污染現象，引物具有良好的特異性。

2.2 實時熒光定量PCR 結果

如圖2所示，在熔解曲線中，只出現單一峰，由此可以排除形成的引物二聚體和非特異產物對試驗結果的影響，說明引物具有非常好的特異性。

通過擴增曲線圖3發現，管家基因與目的基因PrtB 不僅擴增效率極好，而且穩定性也非常好，CT 值的重復性非常好。

圖2 管家基因和目的基因PCR 產物的熔解曲線Fig.2 The melt curves of PCR products of endogenous reference gene and target gene

圖3 管家基因和目的基因PCR 產物的擴增曲線Fig.3 The amplification curves of PCR products of endogenous reference gene and target gene

2.3 不同生長階段胞外肽酶PrtB 基因表達情況分析

2.3.1 保加利亞乳桿菌生長曲線 為探究保加利亞乳桿菌生長的對數期與穩定期，提取RNA。本研究篩選出7 株菌，其中LB08012、LB08014 和LB08016 生長狀況最好。如圖4所示，在確保培養條件一致的情況下，當培養時間為2 h 時3 株菌達到對數生長期；培養時間16 h 達到穩定期。LB08014 活力最強，LB08012 活力最弱。

2.3.2 PrtB 在菌株不同生長階段的表達情況分析 由菌體生長曲線可見，2～16 h，3 株菌株達到生長對數期，穩定期在18～24 h。將6，12，18，24 h 為設置為目的時間。

如圖5所示，選取的3 株菌在生長過程中，目的基因PrtB 在對數初期與穩定期的表達量都顯著下降。選取的4 個時間點中，培養時間為6 h 時PrtB 基因的表達量最大。培養時間12 h 時菌株LB08012 中的PrtB 基因表達量明顯下降（P<0.01）。LB08014 中，目的基因PrtB 在培養時間12 h 時的表達量下降幅度最小，下降2.5 倍。到達對數末期時，其趨于穩定。穩定期時，不發生顯著改變，與對數初期相比有極顯著的差異（P<0.01）。

為探究PrtB 基因受菌株、培養時間與二者因素對相對表達量的影響采用雙因素試驗的方法。通過表3可以發現，PrtB 基因受到菌株與培養時間的影響顯著（P<0.001），不僅如此，二者間交互作用也同樣顯著（P<0.001）。

圖4 保加利亞乳桿菌的生長曲線Fig.4 The growth curve of Lacbobacillus bulgaricus

圖5 菌體不同生長階段目的基因PrtB 表達的動態變化Fig.5 Kinesis of the target gene PrtB during the different growth phase

表3 3 個菌株不同生長時期目的基因的相對表達分析Table 3 Analysis of the relativity quality of the target genes during’ different growth phase of three strains

2.4 不同氮源對PrtB 基因表達的影響

乳酸菌生長體系中的蛋白質通常情況下會被乳酸菌水解，轉化為氨基酸與小分子游離氨基酸來維持菌體自身的生長。

由表4可以看出，氮源條件對于試驗結果影響顯著（P<0.05），且PrtB 基因的表達在不同菌株之間同樣存在顯著差異。此外，如圖6所示，N 缺乏條件與正常MRS 培養條件相比，PrtB 的表達量呈上升的趨勢（P<0.05），平均上調2.4 倍，其在LB08015 中變化最大，在LB08012 中變化最??；添加酪蛋白胨后，PrtB 的表達量顯著下調（P<0.05），平均下調4.1 倍。其在LB08012 中的下降趨勢最為顯著。

2.5 不同初始pH 對PrtB 基因表達的影響

不同的pH 環境會對酶活性影響顯著。

通過調整不同的初始pH，PrtB 基因的表達見表5和圖7。圖7中，pH 顯著影響PrtB 基因的表達，不僅如此，PrtB 基因的表達在不同菌株之間同樣存在顯著差異。在LB08006、LB08007、LB08012和LB08016 中，隨著初始pH 的提高，PrtB 基因的表達水平上調。在初始pH6.5 的培養條件下PrtB的表達量與初始pH5.6 相比，上調5.0 倍，LB08016 與LB08006、LB08007 和LB08012PrtB 的PrtB 表達量相比差異極顯著 （P<0.01）；而 在LB08014 和LB08017 中，當調整初始pH 為5.6時，其表達量明顯低于初始pH5.9、初始pH 6.2 和初始pH 6.5；在LB08015 中，PrtB 的表達呈先上升后下降的規律。

綜上，當調整培養環境的pH 值為5.9，6.2，6.5 時，相比于對照組，LB08006、LB08007、LB08012和LB08016 中目的基因顯著上調，LB08014、LB08015 和LB08017 中的目的基因顯著下調。菌株的差異與培養條件共同影響其基因的表達。

圖6 不同氮源培養下目的基因PrtB 表達的動態變化Fig.6 Kinesis of the target gene PrtB at the different nitrogen source cultivation

圖7 不同初始pH 培養下目的基因PrtB 表達的動態變化Fig.7 Kinesis of the target gene PrtB at the different initial pH cultivation

表4 不同氮源培養下PrtB 的相對表達量（n=3）Table 4 The relative quantity of PrtB at the different nitrogen source cultivation（n=3）

表5 不同初始pH 培養下PrtB 的相對表達量（n=3）Table 5 The relative quantity of PrtB in the different initial pH cultivation（n=3）

2.6 不同溫度對PrtB 基因表達的影響

試驗發現，溫度通過干擾蛋白酶的活性來干擾菌體的生長。本研究通過調整溫度條件來探究PrtB 基因表達的改變。

如表6與圖8所示，12h 后，溫度差異會給PrtB 的表達帶來影響。在LB08006、LB08016 和LB08017 3 種保加利亞乳桿菌中，30 ℃時PrtB 的表達量最高，在37，42 ℃和45 ℃時較30 ℃有所下降。其中，在37、42 ℃和45 ℃時，其呈現出先上升后下降的趨勢。

在LB08007、LB08012、LB08014 和LB08015中PrtB 基因的表達變化呈先上升再下降的趨勢，在37 ℃時達到最高，相對于對照組分別上調了1.3、2.3、5.3 倍和15.5 倍。在LB08015 中差異最大，在LB08007 中差異最?。≒＜0.05）；45 ℃時目的PrtB 基因的表達量最低，與對照組相比分別下降了50，41.7，5.6 倍和1.9 倍。

表6 不同初始溫度培養下PrtB 的相對表達量（n=3）Table 6 The relative quantity of PrtB in the different temperature cultivation（n=3）

圖8 不同溫度培養下目的基因表達的動態變化Fig.8 Kinesis of the target gene in the different temperature cultivation

3 討論

乳酸菌中，乳酸桿菌蛋白的水解能力比乳酸球菌的水解能力強[17-18]。本試驗選取保加利亞乳桿菌為目的菌株。胞外酶、轉運系統與胞內酶為構成蛋白水解體系的主要成分。保加利亞乳桿菌的蛋白水解體系中的胞外酶經過基因鑒定為PrtB 基因，其最重要的功能就是將大分子蛋白水解為多肽。在乳酸菌研究領域，廣泛應用RT-PCR 技術來探討不同樣本或同一樣本在不同處理前、后某一基因的表達水平。

伴隨著菌體的不斷生長，胞外酶PrtB 基因表達水平有所上升，在對數期至穩定期區間，其變化趨勢為下降，達到穩定期后無顯著變化的趨勢。其蛋白在轉綠與翻譯的過程中，由于生物學差異，造成PrtB 的差異。不僅如此，PrtB 的表達水平在不同菌株之間存在顯著差異，這可能是由于菌體自身的生物學活性導致的[19-20]。本研究與Leila Sadat-Mekmene 等[21]的發現一致，其通過探究不同生長時期胞外蛋白酶的變化，得出在對數生長期胞外酶基因的表達量最大，與菌體生長呈正相關。試驗中PrtB 基因表達的下降趨勢與Nicoline Vermeulen 等[15]的研究結果一致，其認為對數期與穩定期Lactobacillus sanfranciscensis DSM 20451T中蛋白酶OppF、DtpT 和PepT 在面團發酵過程中基因表達的水平都是下降的。綜上所述，在對數初期，保加利亞乳桿菌蛋白酶表達量最大，其它時期相對較小。

目的基因PrtB 在無氮源條件下表達量有所增加。本試驗中，添加酪蛋白胨條件與正常MRS培養條件相比，PrtB 的表達量顯著下調。這是由于當培養基添加了酪蛋白胨后，菌體的繁殖非常迅速，穩定期后，菌體蛋白基因表達因游離氨基酸的積累而受到抑制。氮源可以抑制PrtB 基因在蛋白質水解體系中的表達。

當初始pH 增加時，其基因的表達有所增加。這與Rina Wu 等[22]得到的結論一致，其對Lactobacillus casei Zhang 中PepP 基因 在pH 2.5 和pH6.4 環境中的表達進行比較分析，結果顯示該基因在低pH 值下的表達水平也較低，而PrtB 會因生物學的差異而在一些菌株中下降。這種差異同樣表現在蛋白的水平上。pH 值對蛋白的水解率的影響因菌株的差異而有所不同，當菌體細胞膜上的電荷受的pH 值影響時，其膜的通透性發生改變，導致其蛋白酶的活性與氮源吸收率的改變；在較低的pH 條件下，乳酸菌無法平衡細胞內的pH 穩定，使得細胞內的pH 也降低，抑制乳酸菌生長[23]。同樣，菌株的特性決定了抑制的情況[24]。

本試驗結果顯示，在LB08007、LB08012、LB08014 和LB08015 中，PrtB 基因的表達量先上升后下降，在37 ℃最高，45 ℃最低。30 ℃時，低溫同樣使得表達量很低，一部分菌體處于休眠狀態。不僅如此，酶活性也受低溫的影響。PrtB 基因的表達在37 ℃上升，45 ℃下降可能是因為37 ℃為最適的生長溫度，菌體處于對數期生長，所需肽與氨基酸也更多，更多的蛋白質被蛋白酶分解，進而蛋白酶表達水平較高。

綜合以上分析，PrtB 基因活性顯著影響發酵劑的品質。其菌屬與生長環境共同決定其蛋白的水解特性。通過研究發現培養時間、氮源種類、初始pH 和培養溫度是影響其活性的主要條件。

4 結論

PrtB 基因的表達受培養時間、氮源種類和含量、初始pH 和培養溫度的影響。LB08012、LB08014、LB08016 中，PrtB 基因在對數初期至穩定期表達量顯著下降，到穩定期PrtB 基因已不表達。PrtB 的表達量在N 缺乏條件下上升（P<0.05），平均上調2.4 倍，不同的菌種，上升的幅度有差異。PrtB 的表達量在添加酪蛋白胨時顯著下調，平均 下調4.1 倍。隨著初始pH 的提高，PrtB 在LB08006、LB08007、LB08012 和LB08016 中 表 達量上調。在LB08016 中，PrtB 上升幅度最為顯著，上調10.0 倍；在LB08014 和LB08017 中，PrtB 的表達量隨pH 值的升高顯著下調；在LB08015 中，PrtB 的表達隨著pH 值的升高而下降。在45 ℃條件下PrtB 的表達量與對照組（30 ℃下）相比顯著下降（P<0.05）。