何冬萍 朱曉萍 陳麗玲 劉志彬 倪 莉
(福州大學食品科學技術研究所 福建省食品生物技術創新工程技術研究中心 福州350108)
紅曲霉(Monascus spp.)在生長過程會產生紅曲色素、Monacolin 類物質等次級代謝產物。其中,紅曲色素可作為天然食品色素應用于食品工業,而且還具有抗氧化、抗炎癥、抗肥胖、調節膽固醇等作用[1];而Monacolin K 是公認的具有降低膽固醇、血脂調節作用的藥物[2]。紅曲霉一般以糯米為基質進行發酵,最終產品稱為紅曲米,可用于黃酒釀造、食品發酵、紅曲色素生產。除糯米外,也有研究者使用山藥[3]、黑豆[4]等成分作為基質進行紅曲霉發酵,獲得功能性更佳的紅曲色素產品。
葛根(Radix puerariae)是豆科植物,含有豐富的淀粉、黃酮等成分,具有良好的保健功能。其含有的黃酮類物質——葛根素具有抗炎、抗氧化、抗凋亡,擴張血管,保護神經細胞與心肌細胞等藥理活性[5]。以葛根替代傳統糯米作為紅曲霉發酵基質,可以為紅曲霉的生長提供必要的碳源、氮源等營養素,同時葛根中的黃酮還具有調節紅曲霉次級代謝產物的作用。此外,黃酮的引入有可能使紅曲產品具有更好得保健功效。
本課題組前期以葛根作為基質,液態發酵紅曲霉生產紅曲色素,結果發現紅曲色素產量得到顯著提高,并能有效降低桔霉素含量,發酵產物還含有一定的黃酮含量,可能具有一定的抗肥胖、調節血脂等功效[6]。本研究通過小鼠動物實驗評估該葛根紅曲發酵產物的抗肥胖功效。
1.1.1 動 物 40 只SPF 級4 周 齡C57BL/6J 小鼠,由上海斯萊克公司提供。
1.1.2 主要試劑 小鼠脂多糖結合蛋白(LBP)酶聯免疫試劑盒,武漢華美生物工程有限公司;Monaclin K,當地藥店;標準飼料MD12062[16%脂肪,4.00 kcal/(g·m)]和高脂飼料MD12032[45%脂肪,4.73 kcal/(g·m)],江蘇美迪森生物醫藥有限公司。
TE601-L 電子天平,德國賽多利斯公司;AU2700 全自動生化分析儀,奧林巴斯(中國)有限公司;YXOSG41280 型高壓蒸汽滅菌鍋,上海醫用核子儀器廠;CF16RXⅡ高速冷凍離心機,日立中國有限公司;HH-6 數顯恒溫水浴鍋,上海申騰科技有限公司;ULT1386-5-V41 型-80 °C 超低溫冰箱,賽默飛世爾科技有限公司。
1.3.1 MRPE 的制備 將發酵得到的葛根紅曲發酵液于4 500 r/min 條件下離心10 min,得到菌體,用去離子水洗滌3 次,加入70%乙醇溶液、混勻,超聲20 min,于60 ℃條件下提取2 h,重復提取1次,4 500 r/min 條件下離心10 min,得到MRPE。將MRPE 凍干,過100 目篩得到MRPE 粉末,備用。
1.3.2 MRPE 成分測定 采用UV 法測定MRPE中色素含量[7]。將MRPE 粉末溶于70%乙醇溶液,稀釋一定倍數后分別于410,465,510 nm 處測定吸光值,黃色價=OD410nm×稀釋倍數,橙色價=OD465nm×稀釋倍數,紅色價= OD510nm×稀釋倍數,總色價= 黃色價+橙色價+紅色價,單位U/g。采用UV 法測定MRPE 中總黃酮含量,具體操作參考文獻[8]。采用HPLC 測定MRPE 中的桔霉素含量,具體方法參考國家標準《紅曲產品中桔青霉素的測定》GB/T 5009.222-2008[9]。采用HPLC 測定MRPE中Monacolin K 含量,具體操作參考文獻[10]。
1.3.3 動物分組處理 實驗動物飼養于福建省福建醫科大學實驗動物中心。將40 只小鼠飼養于同一間SPF 級屏障動物實驗室的IVC 系統中,小鼠平均體重約為17.00 g/只。隨機選取8 只小鼠喂食正常飼料(C 組),其余32 只小鼠用高脂飼料喂食誘導其形成肥胖,然后隨機分成4 組,繼續喂食高脂飼料并分別灌胃無菌水 (HF 組,n=8),Monacolin K(MK 組,n=8),正常劑量MRPE(MRPE-C組,n=8),高劑量MRPE(MRPE-H 組,n=8),為期4 周。紅曲霉產品的每日推薦攝入量為1.0~2.0 g/成年人[11-12],按體重換算為30 mg/kg,作為小鼠的正常灌胃劑量;以5 倍正常劑量(150 mg/kg)作為高劑量的灌胃劑量。Monacolin K 灌胃劑量約為300 μg/kg。飼養期間,飼養房間內明、暗交替條件為12 h/12 h 的光照循環,每天于晚上7 點關閉日光燈,早上7 點開日光燈。水量和飼料量充足,且小鼠飲水和攝食均自由。每天記錄飲水量和攝食量,每周記錄小鼠體重。
1.3.4 小鼠解剖與取樣 小鼠飼養周期結束后,給小鼠禁食12h 后,稱重后,取眼眶血,用肝素抗凝管收集血液。將小鼠拉直,用直尺量小鼠體長,即鼻尖到肛門的長度,并做好記錄。剪開小鼠腹部皮膚,取下附睪脂肪、腸系膜脂肪、腹膜后脂肪,分別稱重并記錄。
1.3.5 Lee’s 指數 根據小鼠的體重與體長,計算Lee’s 指數。其計算公式為:Lee’s 指數=[體重(g)×1 000]∧(1/3)/體長(cm)。
1.3.6 血清生化分析 采血當日,取200 μL 小鼠血清于Olympus AU2700 全自動生化分析儀中測定血清中的總膽固醇含量 (TC)、甘油三酯含量(TG)、高密度脂蛋白膽固醇含量(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇含量(LDL-C)。
1.3.7 血清脂多糖含量測定 按照脂多糖(LBP)測定試劑盒操作說明書測定血清中脂多糖含量。
1.3.8 數據分析 使用 IBM SPSS 22.0 統計分析軟件的Duncan 檢驗(P<0.05)對試驗數據進行樣本間差異顯著性分析。
紅曲色素是紅曲霉代謝過程中產生的一系列聚酮化合物的混合物,屬于復合色素。根據最大吸收波長的分布可分為三大類:紅色素、橙色素和黃色素?,F已發現100 多種紅曲色素組分[13],其中確定結構的僅有6 種醇溶性色素,即:具有橙色調的紅曲玉紅素 (Monascorubrine) 和紅斑紅曲素(Rubropunctatine);黃色調的安卡紅曲黃素(Ankaflavine)和紅曲素(Monascine);紅色調的紅斑玉紅胺(Monascorubramine) 和紅斑紅曲胺(Rubropunctamine)[14]。從表1可以看到,MRPE 中總色價為(6 500.00 ± 181.87) U/g,遠高于普通米粉發酵的紅曲色素產量(50~2 500 U/g)。其中黃色素含量最高,其次是紅色素,含量最少的是橙色素。MRPE 中Monacolin K 含量較少,(0.11±0.03)mg/g,遠低于作為對照的市售Monacolin K 產品(980 mg/g)。本研究中使用的紅曲霉FZU-MP1501(CGMCC No.12516)屬于高產色素菌株,所代謝的Monacolin K 含量較少[6]。此外,桔霉素也是紅曲霉的次級代謝產物之一,屬于真菌毒素,其安全性受到質疑,也使得紅曲產品的應用受到限制。據日本厚生省對于紅曲產品中桔霉素的限量指標為每500 U 色素中桔霉素含量不超過0.2 μg[15]。本研究使用的MRPE 中桔霉素含量符合該標準。此外,MRPE 中的總黃酮含量為0.43%,表明葛根的添加使得MRPE 中有效活性成分更加豐富。
表1 樣品的成分Table 1 The composition of the sample
經13 周高脂飼料喂養,小鼠體重比正常飼料喂養小鼠高20%,誘導形成肥胖小鼠。對肥胖小鼠繼續喂食高脂飼料并分別灌胃蒸餾水、MK、正常劑量MRPE 和高劑量MRPE,為期4 周,期間其體重變化如圖1所示。灌胃4 周后,MK 組和樣品組小鼠體重均顯著低于HF 組 (P<0.01),MK 組、MRPE-C 組和MRPE-H 組分別比HF 組小鼠的體重降低了9.80%,10.90%和13.00%。MRPE 兩種劑量之間沒有顯著性差異 (P>0.05)。結果表明MRPE 對肥胖小鼠的減重效果不遜于MK,利用葛根紅曲提取物對肥胖小鼠有顯著的體重控制效果。
圖1 小鼠的體重變化Fig.1 Variation of body weight of mice
MRPE 及MK 處理4 周后,取小鼠的腹部附睪脂肪、腸系膜脂肪和腹膜后脂肪分別稱重,并計算三者的總和及其與對應小鼠體重的比值,結果見圖2。小鼠腹部解剖圖見圖3。從圖2可以看出,3 個部位中附睪脂肪所占比例最大。HF 組肥胖小鼠體內脂肪堆積最為嚴重,附睪、腸系膜脂肪和腹膜后脂肪均為最高,總脂體比為(71.23±10.38)mg/g,比C 組高了1.84 倍。MK 組、MRPE-C 組和MRPE-H 組小鼠總脂體比顯著低于HF 組,分別降低39.00%,19.10%和35.60%。與Monacolin K相比,MRPE-C 改善小鼠體內脂肪堆積的效果較弱(P<0.05),而MRPE-H 組與MK 組沒有顯著性差 異 (P>0.05)。MRPE-H 組小鼠總體脂比比MRPE-C 低20.43%,說明在減脂程度上MRPE 具有劑量依賴性。
Lee’s 指數為肥胖指標,綜合考慮了小鼠的體重與體長,是目前評價肥胖程度方面的有效指數。一般來說,Lee’s 指數越大,肥胖越明顯。從圖4的Lee’s 指數可看出,灌胃4 周后,HF 組Lee’s指數最大,這與前面的結果趨勢一致。綜合以上結果可知,葛根紅曲提取物可以防止小鼠體內脂肪堆積,對小鼠體重有顯著的控制效果,在一定程度上具有劑量依賴性。
圖2 各組小鼠各部位脂肪質量Fig.2 Weight of different adipose tissues
圖3 小鼠腹部脂肪解剖圖Fig.3 Anatomical pictures of abdominal adipose
從圖5可以看出,小鼠經4 周不同藥物灌胃后,MK 組、MRPE-C 組和MRPE-H 組小鼠的血清TC 水平均與HF 組有顯著性差異(P<0.05),分別比HF 組低16.22%,10.46%和13.35%;各組小鼠血清TG 水平變化趨勢與TC 水平一致,MK 組、MRPE-C 組和MRPE-H 組的血清TG 含量分別比HF 組低22.34%,28.13%和31.15%;MK 組、MRPEC 組和MRPE-H 組小鼠的血清HDL-C 水平均顯著高于HF 組(P<0.05),分別提高了9.74%,8.83%和7.33%;血清LDL-C 水平中僅MK 和MRPE-H組與HF 組具有顯著性差異(P<0.05),二者分別比HF 組降低了21.23%和14.88%,且MRPE-H 組的血清LDL-C 水平比MRPE-C 組低了8.22%,在一定程度上MRPE 呈現出劑量依賴效果??偟膩碚f,葛根紅曲提取物對肥胖小鼠血脂水平有顯著的改善作用,與Monacolin K 效果相當。
圖4 各組小鼠的Lee’s 指數Fig.4 Lee’s index of each mice group
圖5 各組小鼠的血脂水平Fig.5 Plasma lipids of mices
脂多糖是革蘭氏陰性細菌細胞壁中的一種成分。當細菌死亡溶解或用人工方法破壞菌細胞后會釋放出脂多糖(LPS),導致機體炎癥反應。而內毒素結合蛋白(LBP)是機體受到內毒素刺激時由肝臟合成的急性炎癥反應蛋白,其含量多少可反應血液中內毒素的含量[16]。本試驗將各組小鼠血液,按照試劑盒說明書測定血清中的LBP 濃度,結果見圖6。MK 組、MRPE-C 組和MRPE-H 組的小鼠血清LBP 濃度均與HF 組有顯著性差異 (P<0.05),分別比HF 組降低了40.44%,54.96%和50.46%,表明葛根紅曲提取物在一定程度上降低血清LBP 能力強,具有一定的抗炎癥能力。
圖6 小鼠脂多糖結合蛋白(LBP)濃度Fig.6 Plasma LBP concentration of mice
本研究動物試驗結果表明:MRPE 能夠顯著降低肥胖小鼠的體重、脂肪含量,以及血清TC、TG水平和LBP 含量,且顯著提高血清HDL-C 水平,說明利用葛根作為基質得到的紅曲發酵產物具有良好的抗肥胖功效。從成分分析結果看,由于菌株特性和發酵方式等的不同,MRPE 中成分主要以紅曲色素為主,且MRPE 中成分較普通紅曲米更為豐富,含有黃酮類物質。Jeun J 等[17]研究中,同樣選用C57BL/6 肥胖小鼠進行有關紅曲色素抗肥胖試驗,該研究以100 mg/kg 飼料劑量的紅曲橙色素作為肥胖干預物質來飼喂小鼠,劑量介于本研究正常劑量和高劑量之間,其結果表明橙色素顯著降低了小鼠TC 水平 (實驗組低于對照組約16%)、血清LDL-C 水平 (實驗組低于對照組約26%)并提高血清HDL-C 水平(實驗組高于對照組約9%)??梢?,MRPE 能達到與純化的紅曲色素相當的降血脂效果,其中的黃酮組分可能發揮了一定作用。有趣的是,Chen 等[18]發現紅曲米水溶性提取物(RMR-W)和醇溶性提取物(RMR-E)都能抑制3T3-L1 前脂肪細胞分化,其中RMR-W 還能提高成熟3T3-L1 脂肪細胞的脂肪分解活性,而RMR-E 和洛伐他汀卻沒有顯著影響??梢?,紅曲色素的抗肥胖作用可能并非通過直接調節脂肪細胞實現。
本研究還發現,MRPE 具有降低血清LBP 的作用。肥胖會伴隨輕度炎癥,具有較高的血清LBP水平[19]。LBP 是來源于革蘭氏陰性菌細胞壁的脂多糖,目前有大量文獻報道了腸道菌群的失衡有可能是導致血清LBP 提高的原因,進而引發炎癥,加速肥胖的形成[20]。MRPE 的抗肥胖、降低血清LBP 的作用有可能是通過調節腸道菌群實現。后續需要進一步研究證實MRPE 的腸道菌群調節功能及其它可能的抗肥胖機制。