丁香假單孢菌重組褐藻膠裂解酶的酶學性質及酶解產物的抗氧化活性

吳麗云 朱艷冰，2，3，4* 銀小倩 李鶴賓 倪 輝，2，3，4 肖安風，2，3，4

（1 集美大學食品與生物工程學院 福建廈門361021 2 福建省食品微生物與酶工程重點實驗室 福建廈門361021 3 廈門市食品與生物工程技術研究中心 福建廈門361021 4 廈門市南方海洋研究中心經濟海藻資源化利用與深加工重點實驗室 福建廈門361021 5 廈門醫學院 福建廈門361008）

褐藻膠主要提取自褐藻的細胞壁和細胞間質，它是由β-D-甘露糖醛酸（M）及其在C5 上的差向異構體α-L-古羅糖醛酸（G）通過β-1，4 糖苷鍵連接形成的一類陰離子酸性直鏈多糖，是褐藻酸有機衍生物及褐藻酸鹽的統稱[1]。褐藻膠的降解產物褐藻寡糖的分子質量低，穩定性高，水溶性強，易被人體吸收。它具有多種生物活性，例如解毒、整腸、抗病毒、抑菌、抗自由基氧化、免疫調節和促進生長等。

褐藻膠裂解酶可通過β-消除反應切斷褐藻膠的糖苷鍵，生成不飽和糖醛酸寡糖和單體。根據底物的特異性可將褐藻膠裂解酶分為聚甘露糖醛酸裂解酶（EC 4.2.2.3）、聚古羅糖醛酸裂解酶（EC 4.2.2.11） 以及可同時降解兩種片段的雙功能酶。除了制備褐藻寡糖，褐藻膠裂解酶還可解決銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生物膜的耐藥性[2]，制備原生質體和海藻單細胞[3]，提取RNA、DNA 及其它一些胞內活性物質，分析褐藻膠的結構[4]等。

褐藻膠裂解酶主要存在于海洋細菌、海洋無脊椎動物、真菌和病毒等中。微生物來源的褐藻膠裂解酶具有種類多，便于生產等優點，成為褐藻膠裂解酶的主要來源。產褐藻膠裂解酶的微生物來源包括噬瓊膠菌屬 （Agarivorans sp.）[5]、弧菌屬（Vibrio sp.）[6]、交替單胞菌屬（Alteromonas sp.）[7]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[8]、嗜麥芽寡養單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）[9]、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas sp.）[10]、葉氏假交替單胞菌 （Pseudoalteromonas elyakovii）[11]、產黃菌屬（Flavobacterium sp.）[12]、棒狀桿菌屬（Corynebacterium sp.）[13]和環狀芽孢桿菌 （Bacillus circulans）[14]等。

在先前的研究中，作者對丁香假單孢菌（Pseudomonas syringae） 的褐藻膠裂解酶基因alg進行了克隆及生物信息學分析[15]。本研究在此基礎上進行丁香假單孢菌褐藻膠裂解酶的酶學性質及酶解產物的抗氧化活性研究，為進一步研究該酶的結構與功能奠定了良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 pMD18-T-alg 重組質粒、大腸桿菌（E.coli）BL21（DE3），由本實驗室保存；pET-28a 載體，Novagen 公司。

1.1.2 主要試劑 dNTPs、T4 DNA 連接酶、Taq DNA 聚合酶、EcoRI 和HindIII，TaKaRa 公司；卡那霉素、柱式DNA 膠回收試劑盒和柱式質粒DNA 提取試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；金屬鎳螯合瓊脂糖凝膠6FF，GE Healthcare Life Sciences 公司；D-聚甘露糖醛酸和L-聚古羅糖醛酸，博智匯力生物科技有限公司；其余試劑均為分析純產品。

1.1.3 培養基LB 培養基 酵母粉5 g，NaCl 10 g，蛋白胨10 g，去離子水1000 mL（LB 固體培養基則需添加瓊脂20 g）。

1.2 主要儀器、設備

7200 可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；ALP-高壓蒸汽滅菌器，日本ALP 公司；ZHWY-2102 雙層全溫度恒溫搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；SW-CJ-2FD 型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；Unic3-18K 冷凍離心機，Sigma 公司；AvantiTMJ-25 冷凍離心機，美國Beckman 公 司；7934070 冷凍干燥儀，美國Thermo Fisher 公司。

1.3 重組表達質粒的構建

丁香假單孢菌褐藻膠裂解酶基因alg 的正向引物序列：5′-CCGGAATTCGCACTGGTTCCACCCAAGGG-3′（劃線部分為EcoRI 酶切位點），反向 引 物 序 列：5′-GCGAAGCTTTCGAACCGTCGTTATCGC-3′（劃線部分為HindIII 酶切位點）。以丁香假單孢菌的基因組DNA 為模板，進行褐藻膠裂解酶基因擴增，反應程序：95 ℃預變性5 min，94℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30次循環；72 ℃延伸10 min。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物大小，并進行PCR 產物純化。利用限制性內切酶EcoRI 和HindIII 對目的基因和表達載體pET-28a 進行雙酶切，采用DNA 膠回收試劑盒分別回收目的基因和表達載體，它們的連接產物轉化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞。細胞涂布于LB 固體培養基（含100 μg/mL 卡那霉素），經菌落PCR 驗證后，測序鑒定插入序列，獲得陽性克隆。

1.4 重組褐藻膠裂解酶的誘導表達及純化

挑選陽性單菌落接種于5 mL LB 培養基（含50 μg/mL 卡那霉素），于37 ℃、200 r/min 振蕩培養過夜。取2 mL 活化菌液接種入200 mL LB 培養基（含50 μg/mL 卡那霉素）中，于37 ℃、200 r/min 振蕩培養至OD600介于0.8～0.9 范圍。添加終濃度為0.1 mmol/L 的誘導劑——異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），22 ℃誘導表達14 h。離心收集菌體，加入20 mL 預冷緩沖液（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，15 mmol/L 咪唑，pH 8.0） 徹底重懸。經冰水浴超聲破菌后，于4 ℃、13 000×g 離心15 min，收集上清，參照金屬鎳螯合瓊脂糖凝膠6FF的說明書，利用親和層析對重組蛋白進行分離純化。利用SDS-PAGE 檢測樣品純度及其分子質量，采用Bradford 法[16]測定蛋白質濃度。

1.5 重組褐藻膠裂解酶的性質研究

1.5.1 褐藻膠裂解酶的活力測定 取145 μL 0.5%（質量分數）褐藻酸鈉溶液（以50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4，pH 7.5 配制），加入5 μL 酶液，30 ℃反應20 min，加入150 μL DNS 試劑，沸水浴10 min，冷卻至室溫后，于波長540 nm 處測定反應液的吸光度值。褐藻膠裂解酶的活力定義為：在上述條件下，每分鐘水解底物產生1 μmoL 還原糖（以葡萄糖計）所需的酶量為1 個酶活力單位（U）。

1.5.2 酶的底物特異性研究 配制0.5%的海藻酸鈉、D-聚甘露糖醛酸和L-聚古羅糖醛酸底物溶液，分別加入重組酶，30 ℃下反應20 min，于光波長235 nm 處檢測反應液的吸光度值，測定酶的活力，研究酶的底物特異性。

1.5.3 溫度對酶活性和穩定性的影響 以海藻酸鈉為底物，在20～50 ℃范圍測定酶的活力，研究酶的最適反應溫度。將重組酶分別置于不同溫度下（30，35，40，45，50 ℃和55 ℃）放置0.5～4 h，檢測酶的殘余活力。以未經處理的酶活力為100%，研究酶的熱穩定性。

1.5.4 pH 對酶活性的影響 在pH 6.0～11.0 范圍測定重組酶的活性，研究酶的最適作用pH。所用緩沖液為50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（pH 6.0～8.0），50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0～9.0），50 mmol/L 甘氨酸-NaOH 緩沖液（pH 9.0～11.0）。

1.5.5 金屬離子對重組酶活性的影響 在重組酶中分別添加終濃度為1 mmol/L 的不同金屬離子（Na+、Li+、K+、Hg+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Ba2+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Al3+），37 ℃放置30 min 后檢測重組酶的活力。以不添加金屬離子的酶活力為100%，研究金屬離子對酶活性的影響。

1.5.6 抑制劑和去垢劑對酶活性的影響 在重組酶中分別加入1 mmol/L 或10 mmol/L 的抑制劑（包括EDTA、β-ME、DTT 和PMSF）、0.1%或1%（體積分數或質量分數） 的去垢劑 （包括Tween 20、Tween 80、Triton X-100、SDS 和Chaps），37 ℃放置30 min 后檢測酶的活力。以不添加抑制劑或去垢劑的酶活力為100%，研究抑制劑和去垢劑對酶活性的影響。

1.5.7 重組酶的動力學參數測定 分別配制不同質量濃度的海藻酸鈉溶液（1.5，2.5，3.5，4.5，5.0 mg/mL），測定重組酶在不同底物濃度下的酶活力。利用Lineweaver-Burk 雙倒數作圖法，求解酶的Vmax和Km值。

1.6 酶解產物的抗氧化活性研究

配制1.0%（質量分數） 海藻酸鈉底物于50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 7.5）中，每100 mL底物溶液中加入0.5 U 重組褐藻膠裂解酶，混勻，30 ℃反應8 h 后，沸水加熱10 min 滅活酶蛋白，完全冷卻后，10 000×g 離心20 min，除去沉淀。用10 ku 的濾膜過濾，將濾液冷凍干燥至粉末。按照Wu等[17]的方法進行清除ABTS 自由基、·OH 自由基和還原能力的測定。

2 結果

2.1 褐藻膠裂解酶在大腸桿菌中的表達

利用IPTG 對含有重組質粒pET-28a-alg 的陽性轉化子進行誘導表達，經SDS-PAGE 分析發現，在40 ku 左右有明顯的融合蛋白表達條帶（圖1，道4）。利用親和層析進行分離純化，獲得電泳純的重組褐藻膠裂解酶（圖1，道5），分子質量為40.8 ku，酶的比活力1.9 U/mg，純化倍數23.4，回收率76.3%。

圖1 丁香假單孢菌褐藻膠裂解酶基因在大腸桿菌中的表達Fig.1 Expression of alginate lyase gene from P.syringae in E.coli

2.2 重組褐藻膠裂解酶的性質

2.2.1 酶的底物特異性 分別以海藻酸鈉、聚甘露糖醛酸和聚古羅糖醛酸為底物，研究酶的底物特異性，結果（圖2）顯示，重組褐藻膠裂解酶可降解海藻酸鈉和聚甘露糖醛酸，不具有降解聚古羅糖醛酸的活性，說明該重組酶為聚甘露糖醛酸裂解酶。

圖2 重組褐藻膠裂解酶的底物特異性Fig.2 Substrate specificity of recombinant alginate lyase

2.2.2 溫度對酶活性及穩定性的影響 在不同溫度下測定重組酶的活力，結果（圖3a）顯示，重組酶的最適作用溫度為30 ℃，在20 ℃時具有44%的酶活力，45 ℃時具有36%的活力，而50 ℃時酶活力為零。酶的熱穩定性分析（圖3b）顯示，重組酶在30，35，40 ℃和45 ℃處理4 h 后，酶仍具有85%以上的活力；在50 ℃處理4 h，酶具有63%的活力；在55 ℃處理1 h，酶具有29%的活力，在該溫度下處理2 h，酶活力基本喪失。

圖3 溫度對重組褐藻膠裂解酶活性（a）及熱穩定性（b）的影響Fig.3 Effect of temperature on activity （a） and thermostability （b） of recombinant alginate lyase

2.2.3 pH 值對酶活性的影響 在不同pH 值條件下測定重組褐藻膠裂解酶的活力，結果（圖4）顯示，酶在pH 7.5 時活力最高。在pH 7.0～9.0 之間保持了較高的活力。該重組酶在pH 10.0 條件下仍具有55%的活力，而在pH 6.5 和11.0 時基本上沒有活力。

圖4 pH 值對重組褐藻膠裂解酶活性的影響Fig.4 Effects of pH on recombinant alginate lyase activity

2.2.4 金屬離子對酶活性的影響 1 mmol/L 的不同金屬離子對重組褐藻膠裂解酶活性的影響見表1。K+、Na+、Li+、Ca2+、Mg2+和Al3+對重組酶的活性幾乎沒有影響；Mn2+、Ba2+、Fe3+、Fe2+、Ni2+、Co2+、Cu2+、Zn2+和Hg+對重組酶活性有不同程度的抑制作用，其中Co2+、Cu2+、Zn2+和Hg+幾乎完全抑制重組酶的活力。

表1 金屬離子對重組褐藻膠裂解酶活性的影響Table 1 Effects of metal ions onactivity of recombinant alginate lyase

2.2.5 抑制劑和去垢劑對酶活性的影響 研究不同的抑制劑和去垢劑對重組褐藻膠裂解酶活性的影響，結果（表2）顯示，1 mmol/L 或10 mmol/L 的EDTA 對重組酶表現出微弱的抑制作用；1 mmol/L PMSF 對重組酶活性沒有明顯的影響，而在10 mmol/L 的高濃度下對重組酶活性的抑制率約47%；1 mmol/L DTT 對重組酶抑制率約11%，添加濃度達10 mmol/L 的情況下，幾乎完全抑制酶的活性；β-巰基乙醇對重組酶有激活作用。SDS 對重組酶有強烈的抑制作用，在0.1%或1%的情況下幾乎完全抑制酶的活性；重組酶對其它測試的去垢劑 （包括Tween-20、Tween-80、Triton X-100 和Chaps）具有良好的抗性。

表2 抑制劑和去垢劑對重組褐藻膠裂解酶活性的影響Table 2 Effects of inhibitors and detergents on activity of recombinant alginate lyase

圖5 酶解產物對ABTS 自由基的清除作用Fig.5 ABTS radical scavenging activity of hydrolysate

2.2.6 重組褐藻膠裂解酶的動力學參數 以不同濃度的海藻酸鈉為底物，利用Lineweawer-Burk 雙倒數法測定褐藻膠裂解酶的米氏常數，重組酶的Km和Vmax分別為11.17 mg/mL 和14.12 U/mg。

2.3 重組褐藻膠裂解酶酶解產物的抗氧化活性

2.3.1 清除ABTS 自由基的能力 由圖5可知，酶解產物對ABTS 自由基的清除作用隨著酶解產物質量濃度的增大而增強。當酶解產物質量濃度為3 mg/mL 時，對ABTS 自由基的清除率達到77%。酶解產物對ABTS 自由基的半數抑制劑量IC50為1.56 mg/mL。

2.3.2 清除·OH 自由基的能力 由圖6可知，酶解產物對·OH 自由基的清除作用隨著酶解產物質量濃度的提高而增強。當酶解產物質量濃度為0.5 mg/mL 時，對·OH 自由基的清除率為51%；此后清除作用的增速變緩，酶解產物質量濃度提至1.0 mg/mL 時，對·OH 自由基的清除率達到77%。酶解產物對·OH 自由基的半數抑制劑量IC50為0.56 mg/mL。

2.3.3 還原能力 還原能力是反映物質抗氧化性能的重要指標。測得吸光度值越高還原力越強，抗氧化性能越好。由圖7可知，酶解產物的還原能力隨酶解產物質量濃度的增大而增強，還原能力與質量濃度基本呈正比關系。

3 討論

褐藻膠裂解酶可通過降解褐藻膠制備具有多種生物活性的褐藻膠寡糖。在吳麗云等[15]研究的基礎上，本文將丁香假單孢菌的褐藻膠裂解酶進行異源表達、純化和重組酶的酶學性質研究。

圖6 酶解產物對·OH 自由基的清除作用Fig.6 ·OH radical scavenging activity of hydrolysate

圖7 重組褐藻膠裂解酶酶解產物的還原能力Fig.7 Reducing capacity of hydrolysate

本研究中，重組褐藻膠裂解酶具有專一性降解聚甘露糖醛酸活性，屬于聚甘露糖醛酸裂解酶，與來源自假單胞菌屬 （Pseudomonas sp.QD03）[18]表現出的底物選擇性一致。該重組褐藻膠裂解酶的最適反應溫度為30℃，與假單胞菌屬（Pseudomonas sp.E03）[19]、葉氏假交替單胞菌（Pseudoalteromonas elyakovii）[11]和根瘤農桿菌C58（Agrobacterium tumefaciens strain C58）[20]來源的褐藻膠裂解酶的最適反應溫度相同。該重組褐藻膠裂解酶的熱穩定性研究表明，將酶在40 ℃下溫浴1 h，酶活力基本不受影響；在50 ℃條件下分別放置1 h 和4 h，殘余酶活力分別為80%和63%；在55 ℃下放置30 min，殘余酶活力仍達39%。源自產黃菌屬 （Flavobacterium sp.S20） 的褐藻膠裂解酶[12]在50 ℃下放置1 h，酶活力基本為零，即高溫下酶的熱穩定性沒有本研究中的酶好。假單胞菌屬 （Pseudomonas sp.E03） 的褐藻膠裂解酶[19]在40 ℃和50 ℃下溫浴1 h，殘余酶活力分別約為80%和50%，比本研究中的重組酶較不穩定。本研究中重組褐藻膠裂解酶的最適作用pH7.5，這與假單胞菌屬（Pseudomonas sp.QD03）來源的酶[18]最適作用pH 值一致，高于鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas sp.MJ-3）[10]（最適pH 為6.5）和釀酒酵母2-40（Saccharophagus degradans 2-40）[21]（最適pH 為6.0）來源的酶的最適作用pH 值。

本研究金屬離子的影響中，除K+、Na+、Li+、Ca2+、Mg2+和Al3+對酶活性沒有明顯的影響，其余的一些金屬離子對褐藻膠裂解酶有不同程度的抑制作用。其中，Zn2+完全抑制酶的活性，這與Lee 等[9]的研究結果一致。EDTA 對重組褐藻膠裂解酶表現出微弱的抑制作用，與Inoue 等[22]的研究結果一致，而Sakatoku 等[23]的研究表明，EDTA 嚴重抑制酶的活性。本研究中，1 mmol/L PMSF 對重組酶活性沒有明顯的影響，而在高濃度下對重組酶活性的抑制率約為47%。Ma 等[11]的研究中，在添加1 mmol/L PMSF 條件下也表現出微弱的抑制作用。另外，本試驗中SDS 對重組酶的抑制效果明顯，幾乎完全抑制，這與一些研究報道相同，例如假單胞菌屬（Pseudomonas sp.QD03）來源的褐藻膠裂解酶[18]在添加1 mmol/L SDS 的情況下，其酶活力被完全抑制。除了SDS 以及高濃度的DTT 與PMSF，重組酶對其它抑制劑和去垢劑表現出耐受性，該性質使酶在工業上有一定的應用潛力。

在人體代謝過程中會產生一些活性氧，誘發傷害，例如組織損傷和細胞老化等。人體可以通過攝食一些含有抗氧化性的物質清除這些活性氧。本研究中，酶解產物的體外抗氧化試驗表明，酶解產物具有ABTS 和·OH 自由基清除能力及還原能力，具有良好的抗氧化活性，具有作為抗氧化產品的潛力。