嗜熱鏈球菌噬菌體與宿主相互作用研究進展

趙慧瑩，李言郡，陳 蘇，歐 凱，王 健，何國慶,*

（1.浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058；2.杭州娃哈哈集團有限公司，浙江 杭州 310009）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一類發酵糖類產生乳酸的革蘭氏陽性菌的總稱，包括肉食桿菌屬（Carnobacterium）、腸球菌屬（Enterococcus）、四聯球菌屬（Tetragenococcus）、漫游球菌屬（Vagococcus）以及一些重要的工業乳酸菌，如乳球菌屬（Lactococcus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、片球菌屬（Pediococcus）和明串珠菌屬（Leuconostoc）。嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）屬于鏈球菌屬，是使用最廣泛的商業發酵劑之一，被認為是重要性僅次于乳酸乳球菌的乳業菌種，廣泛用于發酵乳制品（如酸乳及各種奶酪）的制造，它是一種罕見的非致病性鏈球菌。嗜熱鏈球菌的另一個顯著特征是其只能利用少數的糖產生乳酸，包括葡萄糖、乳糖和蔗糖。選擇合適的工業嗜熱鏈球菌菌株是一個漫長的過程，因此要充分利用已發現的可用菌株[1]。但是嗜熱鏈球菌容易受噬菌體感染，導致發酵不完全或失敗，使乳品企業遭受巨大的經濟損失[2]，通常采用環境凈化、菌種輪換等手段控制噬菌體污染[3]，同時檢測噬菌體的手段也日漸完善[4]，然而目前仍未找到徹底消除乳品生產中的噬菌體的方法[5]。因此，獲取嗜熱鏈球菌噬菌體和宿主的遺傳信息，研究分析噬菌體-宿主相互作用，理解噬菌體識別和感染宿主細菌的相關機制，對于預防或控制乳制品發酵環境中的噬菌體具有重要意義。

1 嗜熱鏈球菌噬菌體分類

嗜熱鏈球菌噬菌體經常從干酪發酵劑中被分離出來，與從酸乳發酵設備中分離的噬菌體相比，它們顯示出更豐富的基因組多樣性。最合理的解釋是發酵條件不同，奶酪行業中大量的液體乳清和露天大桶均有利于噬菌體的擴散，還有可能是由奶酪生產中菌種輪換造成的[6]。利用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測受體結合蛋白基因和編碼主要衣殼蛋白的基因，或結合分析結構蛋白含量，是目前用于鑒定新噬菌體分離株類型的2 種主要方法[7-9]。

目前，乳品發酵設備中發現的乳球菌噬菌體生物多樣性被廣泛報道[9-12]，而關于嗜熱鏈球菌噬菌體生物多樣性的研究相對有限[13-16]。所有目前已知的嗜熱鏈球菌噬菌體均屬于有尾噬菌體目、長尾噬菌體科，它們的特點是擁有等距的衣殼（60 nm）和長而不可收縮的尾巴（220～330 nm）以及雙鏈DNA基因組。迄今為止，已發現4 組能感染嗜熱鏈球菌的噬菌體[17]，最常見的有2 組，通過識別特定序列，按結構蛋白含量和DNA包裝方法可分為pac組和cos組[18]，2 組噬菌體分別以溫和噬菌體O1205和裂性噬菌體7201為代表。在目前已測序的64 個嗜熱鏈球菌噬菌體中，34 個為cos組，在剩余的30 個嗜熱鏈球菌噬菌體基因組中，18 個為pac組，另外還發現2 組新的嗜熱鏈球菌噬菌體，即5093組和987組，它們的DNA包裝方式還有待研究[14]。與乳制品鏈球菌噬菌體基因組相比，5903組噬菌體的基因組與非乳制品鏈球菌的前噬菌體具有更大的相似性[13]；而987組噬菌體的基因組則與乳球菌P335噬菌體相似[19]，這2 種新型嗜熱鏈球菌噬菌體的發現表明了繼續探索乳品發酵環境中噬菌體的生物多樣性以及開發穩定的抗性菌株和菌株輪換的重要性。盡管嗜熱鏈球菌噬菌體種類不斷增加，但噬菌體基因組均由類似的模塊區組成，編碼DNA復制和宿主裂解的基因均高度保守，生物信息學的發展可以讓我們更好地了解它們的起源、與其他噬菌體的關系以及其多樣性的成因。

2 噬菌體感染乳酸菌宿主的分子機制

為了進入宿主，噬菌體首先接觸并吸附到細菌的細胞壁上。在對革蘭氏陰性菌噬菌體吸附過程的研究中，已經確定了參與噬菌體-宿主相互作用的2 個組分，其中之一是位于細菌細胞膜（或細胞壁）上的受體，而第2個組分被稱為受體結合蛋白（receptor binding protein，RBP），其存在于噬菌體表面。RBP主要負責識別并與細菌上的受體相結合，在噬菌體感染的第1階段，RBP蛋白識別并與合適的糖受體相結合，然而這種結合是可逆的，因此，最初的噬菌體-細菌相互作用不能確保噬菌體成功感染宿主菌；感染的第2階段，細菌和噬菌體表面的蛋白質之間發生不可逆轉的結合，噬菌體成功吸附到細菌細胞表面。這2 個階段在革蘭氏陽性細菌噬菌體吸附過程中也同樣存在，感染乳酸乳球菌細胞的噬菌體與位于細胞壁上的特定受體（主要是糖類）結合，一般為鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和半乳糖胺[20]。而乳球菌c2組噬菌體則是與乳球菌細菌表面的噬菌體感染蛋白（phage infection protein，pip）相結合完成吸附，乳酸乳球菌的pip是一種完整的膜蛋白[21]，它對于建立噬菌體與宿主之間的可逆和不可逆結合均至關重要；與c2組噬菌體相反，乳球菌噬菌體P335和936組是與其他細菌膜蛋白結合。在建立緊密吸附后，噬菌體將它們的遺傳物質注入到宿主細胞質內，而衣殼仍留在細胞外。然后，噬菌體在細菌體內完成裂解或溶源周期。進入裂解模式的噬菌體立即利用宿主的復制系統和代謝功能復制自身的遺傳物質，合成噬菌體編碼蛋白質，增殖裂解細胞，釋放產生大量的子代顆粒。進入裂解周期的噬菌體被稱為烈性噬菌體，細菌被噬菌體感染就意味著死亡；而進入溶源周期的噬菌體被稱為溫和噬菌體，這類噬菌體將自身的遺傳物質整合到細菌的遺傳物質上，潛伏在細胞中世代相傳，與細菌染色體同步復制，這種休眠形式的噬菌體稱為原噬菌體，其宿主被稱為溶源菌，可以通過各種誘變劑（紫外線、絲裂霉素等）將溫和噬菌體誘導轉化為烈性噬菌體。

3 嗜熱鏈球菌噬菌體受體結合蛋白

與某些感染乳酸乳球菌的噬菌體相比，嗜熱鏈球菌噬菌體的宿主范圍較窄，表明其與宿主細胞表面的相互作用具有高度特異性，通過對這些噬菌體的RBP編碼基因分子的研究，這一點已經被證實。Duplessis等[22]確定cos組嗜熱鏈球菌噬菌體DT1中負責宿主特異性的基因產物為ORF18，其位于尾卷曲蛋白和假定的尾部組分編碼基因的下游，可以與其他λ長尾噬菌體相聯系；通過比較7 個已測序的嗜熱鏈球菌噬菌體的同源物，發現RBP編碼基因由3 個結構域組成：1）高度保守的氨基末端結構域；2）中心域，它是隨機存在的，如果有的話，則包含可變區（VR1）；3）第3個區域含有特定可變區（VR2），被認為是宿主特異性的原因?；谕粗亟M的方法，研究人員成功替換VR2區域，使宿主范圍不重疊的2 個噬菌體擁有了相同的宿主。

然而，VR2區域不是宿主特異性的唯一影響因素，研究人員發現還有其他的影響因素，例如，宿主范圍不重疊的噬菌體卻具有相似的VR2氨基酸序列。嗜熱鏈球菌SMQ-301是一種用于制造奶酪的工業菌株，是幾種噬菌體的宿主菌，已被用于研究噬菌體的生物學性質[23]、常間回文重復序列叢集關聯蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR associated，CRISPR-Cas）系統[24]和糖代謝[25]。Duplessis等[26]分離到噬菌體DT1宿主菌株S. thermophilusSMQ-301的噬菌體不敏感突變體（bacteriophage-insensitive mutant，BIM）S. thermophilusSMQ-301R，噬菌體吸附率明顯降低，對能感染宿主S. thermophilusSMQ-301和衍生BIM的噬菌體DT1及其突變體進行基因組比較分析，確定了導致宿主范圍擴大的核苷酸序列，發現宿主范圍擴增由3 個或更多獨立的尾部相關基因產物介導。而且有報道發現cos組和pac組噬菌體可以感染同一株嗜熱鏈球菌菌株[27]，盡管其各自的結構蛋白編碼基因和DNA包裝機制存在遺傳差異，但該發現使噬菌體受體識別的復雜性進一步提升。這些發現表明，VR2區域分組和宿主范圍與cos組和pac組噬菌體的特征不完全相關。

隨著對5093組噬菌體的鑒定和基因組測序[13]，嗜熱鏈球菌中負責噬菌體-宿主相互作用的組分研究又迎來新發現。5093組噬菌體除裂解盒中的某些基因外，其基因組與先前測序的cos組或pac組噬菌體相關性很小，這種差異延伸到尾部結構模塊，無法確定其明確的RBP編碼基因，這意味著該組噬菌體的吸附機制與此前的嗜熱鏈球菌噬菌體有所不同。然而，對該噬菌體尾部結構模塊內編碼的蛋白質進行生物信息學分析的結果顯示，其中包含假定的尾卷曲蛋白編碼基因（ORF295093）、內溶素編碼基因（ORF315093）和尾纖維編碼基因（ORF355093），證明大多數感染乳酸菌噬菌體基因組結構的保守性。Mcdonnell等[28]對40 個嗜熱鏈球菌噬菌體全基因組進行測序后，對5093組噬菌體的結構蛋白和受體結合蛋白方面的信息進行了補充，更新了該組噬菌體的基因注釋信息。他們發現1 個單獨的基因（RBP0095）替代了噬菌體5093中編碼2 個假想蛋白和1 個水解酶的3 個基因（ORF325093、ORF335093和ORF345093），這個基因被推測為噬菌體5093 RBP的編碼基因，該假設主要基于兩點：1）該基因位于尾部形態形成模塊的3’末端，同時位于裂解模塊之前，與典型的RBP編碼基因位置一致；2）該蛋白C端存在糖類的水解酶。這些相似性表明結合該基因編碼的蛋白產物可結合碳水化合物，同時利用吸附抑制試驗進一步證實該假設。為了排除測序錯誤的可能性，將該基因進行異源表達純化，將蛋白產物與5093組噬菌體0095及其宿主菌S. thermophilusST67009一起孵育，結果表明，噬菌體0095吸附被抑制，再次證明RBP0095與該噬菌體-宿主相互作用有關。該發現擴大了對于5093組噬菌體的認識，為了證明該結論的正確性，需要對更多的5093組噬菌體進行全基因組序列測序，及時對宿主范圍數據及突變分析進行補充。

Mcdonnell等[14]通過對4 個987組噬菌體進行全基因組測序，發現它們的基因序列與乳酸乳球菌群P335噬菌體的基因序列有極高的相似性，確定該組噬菌體RBP編碼基因為ORF19，RBP的N末端與TP901-1、Tuc2009、P335和ul36噬菌體的ORF322基因編碼的上基板蛋白（upper baseplate protein，BppU）的N末端部分具有高水平的氨基酸同一性（約85%），而在C末端有所延伸。同時發現該RBP具有與碳水化合物結合的能力，與噬菌體-宿主相互作用和特異性密切相關。

4 嗜熱鏈球菌噬菌體受體

Quiberoni等[29]通過檢測純化細胞壁經化學和酶消化后的噬菌體吸附率，發現嗜熱鏈球菌噬菌體受體本質上是碳水化合物。當使用十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）或蛋白酶K靶向處理細胞壁蛋白質時，未觀察到噬菌體吸附減少；當使用變溶菌素和三氯乙酸靶向處理肽聚糖及相關結構時，噬菌體吸附明顯被抑制。同時，噬菌體可以通過與葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和核糖等糖類一起溫育而被鈍化。Binetti等[30]在使用更多噬菌體進行實驗時，也有類似的發現。對2 個研究進行比較發現，在使用相同的糖對不同噬菌體進行鈍化時，它們的吸附能力有明顯差異，這表明吸附相互作用的高度特異性與宿主范圍相關聯。

考慮到噬菌體受體本質為糖類，胞外多糖（exopoly saccharides，EPS）和莢膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）的產生和組成也會對噬菌體-宿主相互作用產生影響。產EPS的嗜熱鏈球菌菌株會被噬菌體感染，包括感染噬菌體2972的S. thermophilusRD534[31]和S. thermophilusSfi19，感染其他噬菌體的S. thermophilusSfi2[32]以及感染噬菌體5196和5227的S. thermophilusCSK944[33]等。在對S. thermophilusCSK944的研究中，研究人員發現該菌株的噬菌體抗性突變體為EPS缺陷型菌株，因此可以假設2 種特征之間存在相關性。事實上，Rodríguez等[34]發現一種EPS產量降低的嗜熱鏈球菌突變菌株對噬菌體感染較不敏感，且噬菌體吸附和成斑率（efficiency of plating，EOP）減少。嗜熱鏈球菌中EPS基因位點是高度保守的，但即使是在緊密相關的菌株之間[35]，基因操縱子邊界和內容方面也高度不同。這些發現均有助于驗證嗜熱鏈球菌中噬菌體-宿主相互作用高特異性的假設。然而，細胞表面相關的CPS和EPS有所區別[36]，雖然未確定它們的具體作用，但Forde等[37]推測其可以掩蓋乳酸乳球菌噬菌體的受體。究竟是1 種還是2 種多糖在噬菌體吸附宿主細胞中起作用，還有待進一步研究。

在探究嗜熱鏈球菌菌株中噬菌體受體的組分時，敏感菌株突變產生抗噬菌體菌株的能力非常關鍵。一般來說，在嗜熱鏈球菌標準化實驗中，BIM產生的頻率具有菌株特異性[38]，因此結果是不可預測的。而且嗜熱鏈球菌菌株中可能存在多種抗噬菌體機制，它們具有不同水平的功效和穩定性，使得突變頻率進一步復雜化[39]。隨著CRISPR-Cas系統功能的闡明[40]以及在衍生BIM中檢測額外間隔子技術的進步，發現了許多CRISPR介導的嗜熱鏈球菌BIMs。CRISPR及其相關的cas基因是細菌中噬菌體防御系統的關鍵組成部分。簡而言之，使用各種Cas蛋白[41]，細菌可以整合來自噬菌體入侵核酸的短片段（間隔區），然后CRISPR被轉錄并加工成小的干擾物RNA（crRNA）。當噬菌體DNA再次入侵的時候，crRNA-Cas核糖核蛋白復合物通過堿基配對靶向識別特異性分解噬菌體的DNA，從而獲得對噬菌體的抗性。迄今為止，嗜熱鏈球菌菌株已被證明具有多達4 種CRISPR-Cas系統（CR1-CR4），然而，大多數嗜熱鏈球菌菌株具有2 種類型的CRISPR-Cas系統（CR1和CR3）[42-43]。盡管CRISPR系統已被廣泛研究，并且在細菌噬菌體免疫中起重要作用[44]，但該系統的功能在于破壞細胞內外源DNA，因此，CRISPR介導的BIM在噬菌體-宿主反受體/受體研究中應用十分有限。另外，該系統動態和不穩定的性質[45]表明，僅通過CRISPR系統介導得到抗性的BIM可能不適合直接用于發酵，而且CRISPR系統還可以促進噬菌體基因組進化[46]。從限制修飾系統介導的BIM在細菌增殖過程中出現逃逸突變體的頻率上也可以得出類似的結論[39]。

研究人員還發現了非CRISPR介導的嗜熱鏈球菌BIM。Lucchini等[47]在研究幾種抗噬菌體突變體時發現，噬菌體DNA注入受到影響，噬菌體可以吸附但DNA復制卻不發生，這是由于編碼氯通道蛋白基因的下游發生插入突變，導致跨膜蛋白編碼基因被破壞。Mcdonnell等[48]利用反義產mRNA質粒沉默CRISPR-Cas的方法篩選出更加穩定的非CRISPR介導的嗜熱鏈球菌BIM。目前研究人員已經創造了幾種方法來產生嗜熱鏈球菌的穩定或吸附缺陷型BIMs，包括連續傳代法[49]、次生培養法[50]等。利用這些方法，有可能偏向性地產生吸附缺陷型以及非CRISPR介導的BIMs[38]，這對于研究該物種宿主和噬菌體之間的初始相互作用十分有用。未來對于吸附缺陷型BIMs、受體改變的噬菌體逃逸突變體以及在嗜熱鏈球菌中進行細胞壁相關多糖的研究將是進一步闡明這些噬菌體與其嗜熱鏈球菌宿主相互作用的關鍵。

5 結 語

乳制品市場的快速發展使得乳酸菌噬菌體的研究成為焦點。大多數現代發酵對于過程都嚴格控制，盡管各方共同努力使食品發酵標準化，以生產具有一致感官特性的食品，但噬菌體在加工環境中的持續存在是一個重大挑戰，研究噬菌體感染機制對于降低乳品工業的經濟損失具有十分重要的意義。目前已經發現5 種乳酸菌對噬菌體的防御機制，即噬菌體吸附抑制、阻斷噬菌體DNA注入、限制修飾系統、噬菌體感染流產系統和CRISPR-Cas系統，根據上述防御機制，利用基因工程技術研究出幾種人為防御措施，通過對宿主進行改造，或改變噬菌體的關鍵基因，干擾噬菌體對宿主的侵染，從而為宿主菌提供有效保護，如反義RNA噬菌體防御系統、噬菌體編碼的抗性系統和噬菌體觸發的自殺式系統等。

盡管嗜熱鏈球菌發酵劑在乳制品工業中應用廣泛，但是相比于乳球菌，人們對于嗜熱鏈球菌噬菌體-宿主相互作用的關注較少，對其防治手段也相對不足。因此，可以以乳球菌噬菌體作為模型，加快對嗜熱鏈球菌噬菌體進化和多樣性的研究，揭示它們與各自宿主細胞相互作用的機制，才能更加有效地控制乳制品生產中存在的噬菌體污染。