超高效液相色譜技術在食品安全檢測中的應用研究進展

張敏敏

（安徽省蕪湖市食品藥品檢驗中心，安徽 蕪湖 241000）

“民以食為天，食以安為先”，食品安全是消費者關注的焦點，直接影響消費者的身體健康。食品安全也是一門專門探討在食品加工、貯存、銷售等過程中確保食品衛生及食用安全、降低疾病隱患、防范食物中毒的一個跨學科領域，因此食品安全很重要[1]。食品安全既包括生產安全，也包括經營安全，既包括結果安全，也包括過程安全，既包括現實安全，也包括未來安全。食品安全是指食品無毒、無害，符合營養要求，對人體健康不造成任何急性、亞急性或慢性危害。近年來，盡管食品工業已快速發展，食品安全管理也在不斷加強，但我國的食品安全仍存在不少問題。瘦肉精事件、三聚氰胺事件、蘇丹紅事件、孔雀石綠事件及目前的非洲豬瘟事件等讓消費者對食品安全環境堪憂，因此，對食品中具有安全隱患的因素進行快速檢測成為保障食品安全的重要任務，也是為消費者的生活健康提供有力的保障。利用高效、可靠、快速的分析檢測技術對食品中的非法添加物或有害物質進行檢測，同時依據相應國家標準進行判定，對不合格食品及其生產廠家進行嚴懲，對保障食品安全具有重要意義[2]?，F階段針對食品安全檢測的技術有很多，而超高效液相色譜（ultra high performance liquid chromatography，UPLC）作為一種快速、準確、高效的技術已被廣泛應用在檢測當中，其與質譜的聯用更進一步為食品檢測參數的定性和定量提供了技術支撐。

1 超高效液相色譜儀

UPLC色譜柱是由粒徑小于2 μm的顆粒組成，它是一種能承受很高壓力（高達150 MPa）的系統，這種色譜方法的目的是增加樣本吞吐量或峰值容量[3]，在LC中減少粒度的理論優勢、儀器條件的限制、高壓對流動相性質的影響、高壓液相色譜與UPLC的方法傳遞規則及UPLC生物分析、多殘留篩選和代謝組學方面有一些應用。

UPLC是高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）的衍生，其基本原理是隨著柱填料粒徑減小，效率和分辨率增加。如果將粒徑減小到小于2 μm，效率顯示出顯著增益，并且在流量增加時不會減小。UPLC較HPLC改進的地方主要有[4-6]：1）固定相色譜填料的差別，UPLC的色譜填料是采用雜化顆粒技術合成的高性能微粒，柱粒徑為1.7 μm；HPLC常用C18色譜柱，填料粒徑為5 μm；2）輸液泵的差別，由于色譜柱粒徑小，在使用時柱壓會大大增加，UPLC輸液泵需要采用耐高壓的超高壓輸液泵；3）進樣器的差別，UPLC采用壓力輔助的自動進樣器。UPLC基于經過驗證的HPLC技術，相同條件下提供的信息遠遠高于HPLC，具有更高的速率、分辨率和靈敏度。此外，UPLC的分析時間和消耗的溶劑少于之前使用的色譜技術。在UPLC中，分辨率、拖尾因子和峰面積/峰值保留時間重復性等因素與HPLC相似。另外，UPLC還常同質譜儀聯用，從而提高分析性能，增大離子源的離子化效率，進而提高質譜檢測器的靈敏度，為化合物的定量及定性等提供極大便利[7]。

2 UPLC在食品安全檢測中的應用

2.1 UPLC在乳品添加劑檢測中的應用

甜味劑按其來源可分為人工合成甜味劑和天然甜味劑，安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、阿力甜、紐甜和三氯蔗糖等均為人工合成甜味劑，甜菊糖苷、索馬甜等為天然甜味劑。乳品添加劑是乳品生產過程涉及到的各種食品添加劑，對現代乳品工業發揮著重要作用。Moreno-González等[8]采用液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術鑒定嬰兒乳制品中15 種乳品添加劑的含量，0.05%乙酸和甲醇作為流動相，在6 min內完成分離，采用多重檢測模式，在電噴霧電離正離子模式（electrospray ionization，ESI＋）下檢測分析物，以獲得最高靈敏度，結果表明，該方法靈敏度高、適用范圍廣、快速簡便，適用于不同嬰幼兒食品中乳化劑殘留量的檢測。Aguilera-Luiz等[9]采用UPLC-MS/MS簡便、快速測定肉基嬰兒食品和乳粉型嬰兒配方中不同獸藥殘留，在3 個不同添加水平下分別在2 種嬰兒食品基質中進行驗證，得到合適的回收率和精密度（日間和日內精密度），用矩陣匹配進行量化，結果表明，該方法基于緩沖液的性質，使得提取過程快速、簡便、廉價、有效、安全，無需進一步的清理步驟。Kukusamude等[10]以四丁基溴銨為離子偶聯劑，以乙腈為萃取劑，建立一種離子偶聯萃取法測定牛肉和牛乳樣品中青霉素類抗生素（青霉素G、奧西林和氯西林）的方法，并采用HPLC進行分析，條件如下：XbridgeTMC18反相柱、等壓洗脫、紫外檢測波長215 nm、流動相選用磷酸鹽緩沖液（pH值6.6）和25%乙腈、流速為1 mg/mL，3 種青霉素的分離在10 min之內就完成了。

Schmidt等[11]建立UPLC測定牛乳制品中VB1活性成分的方法，包括牛乳中的硫胺素、單磷酸鹽硫胺素和二磷酸硫胺素，為了維持天然VB1磷酯，樣品制備至關重要。比較各種酸、常用酶及其混合物的效果。采用標準品驗證方法的準確性，并與相應的歐洲標準化委員會（Comité Européen de Normalisation，CEN）方法進行比較，結果表明，牛乳樣品中含有大量的單磷酸鹽硫胺素，占商品牛乳中VB1總含量的53.9%，原料牛乳中VB1含量高達78%。此外，單頭奶牛牛乳中VB1的總含量也有很大變化，含量范圍為0.24～0.54 mg/L。2.2 UPLC在食品添加劑檢測中的應用

食品添加劑包括防腐劑、合成著色劑、甜味劑等，在調控食品的色澤、香氣、味道及食品貯藏方面具有重要作用。我國制定了相關規定及標準，對食品添加劑的使用量及類型做出了具體的規定。然而，部分不法商家為了過分追求產品的外觀及延長保質期，在生產中使用過量的合法添加劑，或者使用具有危害作用的非法添加劑，利用UPLC方法快速檢測這些添加劑已有報道。

Rubert等[12]使用一種快捷、方便、便宜、有效和提取安全的UPLC-MS/MS法，成功開發和驗證分析26 種化合物，它們可以用于不同疾?。ㄈ缰委焻捠?、用作興奮劑、抗焦慮藥、抗抑郁藥和瀉藥）的治療，這些化合物都是容易被非法添加到減肥食品補充劑中的物質。內標法標記化合物在5～1 000 μg/L的線性范圍內呈現良好的線性關系，這取決于化合物和良好的靈敏度。張劍鋒等[13]建立利用UPLC方法檢測飲料中山梨酸等5 種添加劑的方法，飲料直接加水后，經C18柱分離（BEH，2.1 mm×100 mm，1.7 μm），在225 nm波長處檢測，結果表明，在線性范圍內，樣品中的5 種物質回收率達95.5%～100.2%，相對標準偏差為1.0%～3.1%。凌云等[14]利用UPLC和質譜聯用的方法檢測調味料中的山梨酸等11 種防腐劑和丁基羥基茴香醚（butylated hydroxyanisole，BHA）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT）等6 種抗氧化劑，樣品經飽和NaCl水溶液稀釋混合，乙腈提取，正己烷液-液萃取凈化，提取液經C18反相色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）分離，流動相為20 mmol/L乙酸銨水溶液＋乙腈，梯度洗脫，以ESI-、多反應監測模式進行檢測，結果表明，11 種防腐劑和6 種抗氧化劑在線性范圍內均具有良好的線性關系，相關系數r≥0.995 5，定量限可達0.05～5.00 mg/kg，回收率為79.7%～118.0%，相對標準偏差為0.57%～13.10%，該方法較國家標準方法簡便、快速。

2.3 UPLC在非法添加物檢測中的應用

非法添加物是指法律法規允許使用的添加劑之外的物質，非法添加物的使用嚴重危害消費者的健康[15]。毛江勝等[16]建立UPLC-MS檢測辣椒中蘇丹紅Ⅰ-Ⅳ的方法，樣品首先利用正己烷提取，使用Sep-Pak Alumina B固相萃取柱凈化，再利用C18色譜柱（Waters BEH，50 mm×2.1 mm，1.7 μm）分離，流動相采用0.1%甲酸-乙腈溶液和0.1%甲酸水溶液進行梯度洗脫，蘇丹紅Ⅰ-Ⅳ的檢出限為0.05 ng/mL，標準品回收率達到83.8%～99.0%。三聚氰胺是乳品、雞蛋加工中的非法添加物，胡梅等[17]建立UPLC-MS/MS快速檢測雞蛋加工中三聚氰胺的方法，三聚氰胺的檢測限可達0.05 mg/kg，加標回收率為89.4%～98.3%，相對標準偏差為3.35%～6.37%；與HPLC或LC-MS檢測相比，UPLC-MS/MS方法省去了固相萃取柱的凈化過程，樣品全部前處理過程在15 min即可完成，精密度和靈敏度均可滿足檢測要求。

在歐盟官方的監控項目下，抗生素被控制在食用動物的組織中。然而，關于獸醫實踐中藥物的過度使用，迫切需要找到一種替代死后分析抗生素的方法。利用羽毛作為非傳統基質，可以在鳥類繁殖過程中控制抗生素的使用[18]。非法添加添加劑和化學污染物是突出的問題，由于高分辨質譜（high resolution mass spectrum，HRMS）的優勢，LC與HRMS的結合在食品安全分析中得到越來越多的應用，但大多數相關的分析方法都是針對特定的已知化合物進行檢測，對于食品中未知的有害化合物，非靶向篩選方法是一種補充方法。然而，在非目標物分析中仍存在許多挑戰。最近的研究為關于樣品制備、LC-HRMS概要分析、數據預處理、差異分析、鑒定不屬于預定目標的未知化合物和非法添加劑[19]。

2.4 UPLC在食品污染物檢測中的應用

對于食品污染物，1983年，聯合國糧農組織和世界衛生組織食品添加劑法規委員會第16次會議規定：凡不是有意加入食品中，而是在生產、制造、處理、加工、填充、包裝、運輸和貯藏等過程中帶入食品的任何物質都稱為污染物，但不包括昆蟲碎體、動物毛發和其他不尋常的物質；殘留農藥也應算是污染物。污染物可為化肥、農藥、抗菌素、激素、藥物和包裝材料溶出物等。風險分析中對人類消費食品存在風險的危害物大體上分為以下幾個部分：農藥殘留、獸藥殘留、其他來源化學污染物、生物（天然）毒素、食品添加劑及飼料添加劑[20-21]。食品生物污染主要是指細菌、微生物、寄生蟲、病毒、昆蟲及其分泌物的污染，這種污染相對容易處理。除了能引起食物中毒和人畜共患病的致病菌外，食物中的細菌還包括能引起食物變質的非致病菌，其可作為食物污染的標志。食品化學性污染涉及范圍較廣且情況復雜，主要包括來自生產、環境中的污染物，如農藥、獸藥等，以及食品容器、包裝接觸食品時溶入食品中的有害物質，濫用食品添加劑也是引起食品污染的主要來源。因此，采用有效的方法對食品中的污染物進行檢測很有必要。

2.4.1 農藥殘留污染

農藥在現代農業種植中發揮著很重要的作用，農藥的合理利用可以有效提高作物的產量和減少病蟲害的危害，而一旦濫用，大量的農藥由于不能有效降解而殘留在作物中，進而危害人們的飲食健康。

農藥殘留是指農藥使用后一段時間內農藥原生質、有毒代謝物、有機物、收獲物、土壤農藥殘留、水體和大氣中未分解的微量農藥、降解物質和雜質直接或間接殘留在糧食、蔬菜、水果、畜產品、水產品、土壤和水中。由于農藥殘留具有微量、受熱易降解或失活的特性，因此其檢測方法就要求更高效、簡便、準確。劉永強等[22]將樣品經乙腈提取、凈化、洗脫，利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜（ultra-high performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF/MS）技術，對辣椒粉中滅多威、吡蟲啉等27 種農藥殘留進行快速篩查，結果表明，27 種農藥殘留化合物在線性范圍內線性關系良好，回收率達72.3%～118.9%，相對標準偏差為0.21%～12.70%，表明該方法適用于辣椒粉中多種農藥殘留的快速檢測。李娟等[23]通過UPLC-ESI-MS/MS方法測定蔬菜、水果中27 種農藥殘留，該方法在多反應監測模式下測定，樣品中的化學成分在20 min內完成分離。陳達煒等[24]建立UPLC-同位素稀釋-HRMS法檢測紅葡萄酒中18 種農殘的方法，選用6 種同位素內標進行內標法定量，有效克服了前處理過程及基質效應可能帶來的誤差，方法準確性和重現性有大幅提升。張聰等[25]利用UPLC-MS/MS法測定食品中10 種農藥殘留，樣品通過凈化、去雜、排除基質效應后上樣分析，在10 min內對10 種擬除蟲菊酯類化合物完成了檢測，這一方法有效滿足了快速檢測的要求。

2.4.2 獸藥殘留污染

獸藥殘留是指對生病的動物進行用藥后蓄積或存留于畜禽機體或產品（如蛋制品、乳制品、肉制品等）中的原型藥物或其代謝產物，一般包括與獸藥有關的雜質殘留[26]。

獸藥殘留多是治療動物疾病時不能準確把控，過量使用藥物，致使一部分藥物不能被動物吸收或是藥物經動物代謝成代謝產物而存于體內，在人類食用后轉移至人體。人類長期食用獸藥殘留超標的食品時，這些獸藥殘留不能被人自身代謝系統代謝，體內殘留量達到一定程度時將會引發人體產生多種急、慢性中毒，或導致人類耐藥菌株的產生，還可能具有致畸、致癌、致突變風險[27]。程建橋等[28]建立嬰幼兒配方乳粉中17 種頭孢菌素類藥物殘留的UPLC-MS檢測方法，利用HRMS Full MS/dd-MS2掃描采集數據，發現17 種頭孢菌素類藥物在線性范圍內線性關系良好，回收率達69.6%～91.4%，相對標準偏差均小于10%，該方法能達到快速篩查的目的。陳秋華等[29]采用UPLC-四極桿質譜法建立草魚、蝦、蟹等水產品中16 種激素殘留的檢測方法，結果準確性較高，為快速檢測水產制品中的激素殘留提供了有效的技術手段。李麗萍等[30]利用UPLC-MS/MS技術測定豬肉中6 種玉米赤霉醇類物質，采用多反應監測模式進行MS/MS檢測，結果表明，目標物線性關系良好，方法重現性好，為肉制品中玉米赤霉醇類物質的快速定性和定量檢測提供了參考。

2.4.3 生物毒素污染

生物毒素是由各種生物自身產生的有毒物質，即天然毒素，它是生物來源的并不可自復制的有毒化學物質，包括動物、植物、微生物產生的對其他生物物種有毒害作用的各種化學物質。

Suzuki等[31]研究高脂雙殼類海洋生物毒素，以UPLCMS/MS、多離子反應監測為基礎，采用時間段極性切換，建立同時測定牡蠣和貽貝中6 種腹瀉性貝類毒素（5 種酸性生物毒素和1 種中性生物毒素）的靈敏、可靠的方法，研究UPLC流動相老化對腹瀉性貝類中毒（diarrhetie shellfish poisoning，DSP）毒素MS檢測靈敏度和保留時間漂移的影響，將所建立的方法成功應用于韓國水產市場采集的40 份牡蠣和貽貝樣品中DSP毒素的定量分析。

2.5 UPLC在食品微生物代謝產物檢測中的應用

微生物代謝是指微生物在生存過程中的代謝活動，微生物在代謝過程中會產生多種代謝產物，根據代謝產物與微生物生長和繁殖的關系，其可以分為初級代謝產物和次級代謝產物。初級代謝產物是微生物生長和繁殖所需的物質，次級代謝產物是生長和繁殖非必需的物質，因其復雜的微生物和化學結構沒有明顯的生理功能。

食品中存在著大量的微生物及其代謝產物，其中有些對人體有益，有些則對人體具有較強的致癌和致畸性。真菌毒素是一類由真菌產生的具有毒性的次級代謝產物，常見的有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮及展青霉素等，它們廣泛存在于糧油及其制品、食品及飼料中。由于其具有較強的毒性和污染范圍較廣，已引起國際上的高度重視[32]。廉慧鋒等[33]建立利用UPLC-MS法對花生、玉米、麥仁中的9 種真菌毒素進行檢測的方法，線性關系良好，符合痕量分析要求，為其他基質中多種真菌毒素含量的同時測定提供了參考。葉金等[34]采用不經過柱凈化而直接對樣品進行提取稀釋的快速前處理方法，結合穩定同位素稀釋技術排除基質效應的影響，利用UPLC-四極桿/靜電場軌道肼-HRMS法，對小麥中16 種真菌毒素進行快速檢測，該方法可滿足大量糧食樣品中真菌毒素快速、準確定性及定量分析的要求。2.6 UPLC在保健食品檢測中的應用

生活節奏的不斷加快導致亞健康人群的擴大，人們的保健意識逐漸增強，市售保健食品也琳瑯滿目。有些不法商販為了牟取暴利，向其中加入化學藥品或添加劑，以達到替代有效成分的目的[35]。保健食品作為一種功能性食品，能夠緩慢達到調節人體機能的作用，但不以治療為目的，故適用于特定人群。不法商販非法加入化學藥品或添加劑，有時可能導致患者或消費者食用后與自身服用的藥物作用疊加，造成機體的更大傷害，甚至可能危及生命[36]。

血糖是指存在于血液中的葡萄糖，血糖升高可能與飲食、疾病等有關。若血糖值較正常值稍高一些，未達到糖尿病的診斷標準，可以通過改變生活方式來干預。市面上降血糖的藥物很多，我國已出臺的降血糖非法藥物檢測標準已經不能滿足日常監管的需求[37-39]。胡青等[40]建立UPLC-三重四極桿質譜法，在ESI＋或ESI-模式下，以多反應監測模式檢測，對流動相、樣品前處理、基質效應和質譜條件等進行優化，對食品中28 種降糖類非法添加物進行檢測，該方法在原有標準和文獻報道方法的基礎上擴大了化合物的檢測范圍，且方法快速、準確，可以應用于日常檢測，為打擊非法添加行為提供了技術支撐。

腎小球濾過率（glomerular filtration rate，GFR）是在慢性腎臟疾病或其他腎臟功能相關疾病背景下評估腎功能的最重要工具之一[41]。目前，碘己醇是一個很好的GFR評估候選物質[42]，它表現出最小的蛋白結合率和最小的腎外間隙，在腎小管水平上既不分泌也不重新吸收。Martin等[43]采用微吸附采樣系統提取毛細管血液中的碘己醇，提出并評價了一種新的LC-MS/MS測定方法。

肥胖癥是一組常見的代謝癥群。當人體進食熱量多于消耗熱量時，多余熱量以脂肪形式貯存于體內，其量超過正常生理需要量，且達一定值時演變為肥胖癥。正常男性成人脂肪組織質量占體質量的15%～18%，女性占20%～25%。隨年齡增長，體脂所占比例相應增加。肥胖的評估方法包括人體測量學、雙能X線吸收法、超聲、CT及紅外線感應法等。如無明顯病因者稱單純性肥胖癥，有明確病因者稱為繼發性肥胖癥。肥胖癥是目前危害身體健康的主要病癥之一，減肥類保健食品成為人們的首選，而非法添加化合物對人體產生的危害遠大于減肥本身[44-45]。董喆等[46]利用UPLC-四極桿/靜電場軌道阱質譜法快速篩查減肥類保健品中常見的20 種非法添加藥物，并對其含量進行定量分析，結果表明，20 種藥物在相應的質量濃度范圍內具有良好的線性關系（r＞0.995），20 種非法添加藥物的檢出限可達0.03～10.00 ng/mL，加標回收率為78.5%～98.6%，相對標準偏差為2.11%～9.21%，該方法對非法添加減肥藥物的檢測快捷、方便，為食品安全監管提供了便利。

3 結 語

UPLC因其檢測的準確性、高靈敏度及分析速度快，在食品安全檢測中已成為一種重要的檢測工具，與MS的聯用更是拓寬了UPLC的適用范圍，滿足了一些復雜混合物中痕量物質的分析要求。隨著分析技術的不斷提高，UPLC將在以后的食品安全檢測實際應用中發揮更大的效力。與傳統的HPLC相比，UPLC的速度、靈敏度及分離度均較優，能夠縮短分析時間，同時減少溶劑用量，降低分析成本，是對化合物進行定性、定量的好工具。