熱處理對乳蛋白結構和消化特性的影響

吳相佚，劉澤朋，毛學英*

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

牛乳蛋白質中含有人體所需的氨基酸，在生長發育中起著重要作用[1-2]，且蛋白質品質優[3]。近年來，通過物理或化學方法對牛乳蛋白質進行改性是研究熱點，即通過酶解或物理方法（如熱處理、超高壓和超聲波等）使氨基酸和多肽鏈發生變化，從而引起蛋白質空間結構和理化性質的變化，改性后的蛋白質功能特性和營養特性得到改善[4]。因此，尋找一種適當的處理方法對牛乳進行加工，提高牛乳的營養特性備受關注。

蛋白質的物理改性是指利用熱、超高壓、超聲波等物理作用形式來對蛋白質進行改性，物理改性會改變蛋白質的高級結構和分子間聚集方式，但通常不會改變蛋白質的一級結構[5]。近年來，熱處理已經成為一種常用的物理改性方法。王婷婷等[6]對牦牛乳進行熱處理后發現，熱處理會引起牛乳體系濁度和粒徑的增加。除此之外，研究表明，熱處理會對乳蛋白的消化性產生一定影響[7]。因此，本研究通過對乳蛋白進行熱處理，研究熱處理后乳蛋白結構及消化特性的變化，對提高乳蛋白消化特性的進一步研究具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃縮乳蛋白70（milk protein concentrate，MPC70）、胰蛋白酶（Trypsin 1∶250）、胃蛋白酶（Pepsin 1∶10 000）美國Sigma公司；丙烯酰胺（acrylamide，AM）、甲叉丙烯酰胺（bis-acrylamide，BIS）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、三羥甲基氨基甲烷（tris（hydroxymethyl） methyl aminonethane，Tris）、過硫酸銨（ammonium persulphate，AP）、N,N,N,N’-四甲基乙二胺（N,N,N,N’-tetramathylethylenediamine，TEMED）美國Amresco公司；無水乙醇、冰乙酸、無水甲醇、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉北京化工廠。

1.2 儀器與設備

LGJ-10真空冷凍干燥機 北京松源華興生物技術有限公司；MDF-C8V1醫用低溫箱 松下健康醫療器械（上海）有限公司；DSHZ-300A旋轉式恒溫振蕩器北京博宇寶威實驗設備公司；DHG-9030電熱鼓風干燥箱上海一恒科學儀器有限公司；FE20 pH計 瑞士梅特勒-托利多公司；電泳槽、iMark酶標儀 伯樂生命醫學產品（上海）有限公司；RF-6000熒光分光光度計島津集團（香港）有限公司；MOS-500圓二色譜（circular dichroism，CD）儀 法國Bio-Logic公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品準備

稱取適量MPC70，用去離子水配制成40 mg/mL的乳液，磁力攪拌2 h使其充分溶解。分別在25、75、85、95 ℃加熱15 min，冷卻至室溫，取樣調節pH值至7.0后冷凍干燥。

1.3.2 表面巰基含量的測定

采用Ellman’s 5,5’-二硫代雙-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB）法測定不同處理后MPC70溶液的表面巰基含量[8]。稱取適量MPC70凍干樣品，溶于蒸餾水配制為質量濃度2 mg/mL的溶液；吸取1 mL蛋白溶液，順序加入4.0 mL Tris-甘氨酸（Gly）緩沖液Ⅰ和50 μL Ellman’s試劑，混合均勻后于37 ℃恒溫培養箱反應15 min；反應后于412 nm波長處測其吸光度。表面巰基含量按下式計算。

式中：A412nm為樣品在412 nm波長處的吸光度；n為稀釋倍數；ρ為樣品質量濃度/（mg/mL）。

Ellman’s試劑配制：稱取0.2 g DTNB，溶于50 mL Tris-Gly緩沖液Ⅰ，4 ℃避光保存。

（六）生化試驗 取上述分離菌血清肉湯培養物，分別接種于蔗糖、山梨醇、葡萄糖、甘露糖、乳糖、馬尿酸鈉及淀粉培養基，37℃培養24 h后，觀察其對糖的利用情況，全部重復三次，并記錄結果見表1。

1.3.3 表面疏水性的測定

采用8-苯胺基-1-萘磺酸（8-a n i l i n i o-1-naphthlenesulfonic acid，ANS）熒光探針法[6]測定熱處理后MPC70表面疏水性的變化。用0.01 mol/L pH 7.4 PBS將熱處理后的蛋白樣品稀釋為質量濃度分別為0.2、0.4、0.8 mg/mL的溶液，取2 mL蛋白稀釋溶液與10 μL 8 mmol/L的ANS溶液混合均勻，測定熒光強度。激發波長為390 nm，發射波長為470 nm。以蛋白質量濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標，曲線初始段的斜率為表面疏水性。

1.3.4 圓二色光譜的測定

稱取適量MPC70凍干粉，溶于蒸餾水配制成質量濃度為0.2 mg/mL的待測樣品溶液。設置圓二色光譜儀掃描范圍為遠紫外區190～250 nm。以蒸餾水為空白，圓二色譜圖譜經過儀器本底消除和溶液空白消除后進行擬合[9]。

1.3.5 MPC70的酶解及體外模擬胃腸消化

取熱處理MPC70凍干粉，采用兩步法模擬胃腸消化，步驟如下：1）取熱處理后樣品，調節pH值至2.0，按照酶與底物質量比為1∶50加入胃蛋白酶，于37 ℃恒溫振蕩器酶解2 h，取樣待用；2）取胃蛋白酶酶解2 h樣品，調節pH值至7.5，按照酶與底物質量比為1∶50加入胰蛋白酶，于37 ℃恒溫振蕩酶解2 h，取樣待用。

調節MPC70胃消化液和胃腸消化液pH值至7.0后冷凍干燥。

1.3.6 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）

非還原型上樣緩沖液的配制：量取1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）3 mL，加入25 mL 50%甘油、10 mL 10% SDS及5 mL 1%溴酚藍，加入去離子水定容至50 mL，振蕩至充分溶解；還原型上樣緩沖液的配制：量取1 mol/L Tris-HCl（pH=6.8）3 mL，加入25 mL 50%甘油、10 mL SDS固體粉末、5 mL 1%溴酚藍及2.5 mLβ-巰基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME）后，加入去離子水定容至50 mL，振蕩至充分溶解。

稱取凍干后樣品，用去離子水配制成質量濃度40 μg/μL的溶液，振蕩使其充分溶解，加入上樣緩沖液將樣品稀釋至4 μg/μL，振蕩使其充分混合后于100 ℃水浴鍋內加熱5 min，取出冷卻至室溫。分離膠質量分數為12.5%，堆積膠質量分數為5%。膠孔中加入5 μL樣品，使蛋白上樣量為20 μg，調節電壓為90 V，待Marker條帶分開，調節電壓為110 V。電泳結束后加入考馬斯亮藍染色2～4 h，加入脫色劑脫色12 h。

1.4 數據處理

結果以平均值±標準差表示。采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，多組數據間進行顯著性分析時，使用單因素方差分析（One Way ANOVA）伴隨Duncan’s多重比較，當P＜0.05時認為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 熱處理對MPC70蛋白組成的影響

圖1 MPC70經不同熱處理后的SDS-PAGE圖譜Fig. 1 Analysis of SDS-PAGE of MPC70 after different heat treatments

由圖1可知，各樣品主要包含αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白5 個條帶。泳道1～4為非還原型電泳，如泳道1～4所示，經過熱處理后，乳清蛋白的變化較明顯。與25 ℃熱處理樣品相比，隨著熱處理溫度的升高，β-乳球蛋白條帶逐漸變淺，當熱處理溫度達到95 ℃時，其條帶最淺。當熱處理溫度達到85 ℃時，α-乳白蛋白條帶明顯變淺。而熱處理后的酪蛋白條帶幾乎沒有明顯變化，表明酪蛋白的含量并未降低，這與酪蛋白的熱穩定性有關。還原型電泳是在上樣緩沖液中加入β-ME，其作為強還原劑能夠斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵[10]。通過比較還原型電泳和非還原型電泳泳道可知，非還原型電泳（泳道1～4）膠孔出現聚集物，而還原型電泳（泳道5～8）聚集物消失，即經過熱處理后減少的乳清蛋白形成了聚合物。同時，添加β-ME后聚合物消失，表明乳清蛋白聚合物之間通過二硫鍵結合而成。研究發現，乳清蛋白對熱不穩定，在加熱過程中會與酪蛋白發生聚合[11]。在加熱條件下，β-乳球蛋白也會發生變性聚合，溫度升高會引起變性程度更大的聚合物形成[12]。到達85 ℃時，α-乳白蛋白也會發生變性，與β-乳球蛋白聚合物形成復合體[13-14]。

2.2 熱處理對MPC70表面巰基含量的影響

由圖2可知，樣品經過75 ℃熱處理15 min后，其表面巰基含量與25 ℃處理組相比沒有顯著變化。與25 ℃處理樣品相比，當熱處理溫度達到85、95 ℃時，MPC70的表面巰基含量顯著升高。巰基是蛋白質分子中重要的功能性基團，通過形成二硫鍵維持蛋白質高級結構的穩定，從而影響蛋白質的功能特性[15]。乳蛋白中巰基基本位于β-乳球蛋白上，當溫度高于85 ℃時，β-乳球蛋白會發生熱變性，暴露出內部隱藏的巰基，從而導致表面巰基含量增加[16]。

2.3 熱處理對MPC70表面疏水性的影響

圖3 不同熱處理對MPC70表面疏水性的影響Fig. 3 Effects of different heat treatments on the surface hydrophobicity of MPC70

由圖3可知，MPC70經過熱處理后其表面疏水性顯著上升，當熱處理溫度達到95 ℃時，表面疏水性最高。疏水相互作用在維持蛋白質結構中起著主要作用，對蛋白質氫鍵和靜電引力有促進作用。一定程度的熱處理會使蛋白質的多肽鏈展開，暴露出活性基團，從而使蛋白質的表面疏水性上升?；钚曰鶊F的暴露也會使蛋白質的酶切位點暴露，引起消化性的升高[6]。

2.4 熱處理對MPC70二級結構的影響

表1 熱處理強度對MPC70二級結構組成的影響Table 1 Effects of heat treatment on the secondary structure of MPC70

由表1可知，MPC70經過熱處理后，α-螺旋含量降低，經過95 ℃處理15 min后，其含量顯著降低至4.4%。隨著熱處理溫度的升高，β-折疊含量呈現先增多后減少的趨勢，而β-轉角含量呈現先減少后增多的趨勢。無規則卷曲呈現先減少后增多的趨勢，且95 ℃處理15 min的樣品無規則卷曲含量多于對照組。

熱處理過程中，乳蛋白發生變性，存在于蛋白質折疊區的β-折疊含量升高，當溫度繼續上升時，α-乳白蛋白發生變性，與β-乳球蛋白聚集，導致β-折疊含量減少[17]。二級結構的改變是由于蛋白質分子外部環境的變化，且這種改變并不是產生新的二級結構，而是已存在的結構發生構象改變和折疊[18]。無規則卷曲含量增多表明熱處理引起的乳蛋白二級結構改變使乳蛋白結構的隨機性增強，有序結構逐漸向無規則卷曲結構轉化[19]。

2.5 熱處理對MPC70消化性的影響

圖4 熱處理MPC70體外模擬消化過程SDS-PAGE圖譜Fig. 4 Analysis of SDS-PAGE of digested MPC70 after being heated at 25 and 95℃

由圖4可知：胃消化后總蛋白含量明顯減少（泳道2、5），25 ℃處理組的酪蛋白條帶比95 ℃處理組樣品淺，表明95 ℃處理樣品的酪蛋白在胃消化中消化程度降低；胃消化后β-乳球蛋白和α-乳白蛋白條帶顏色較深，這表明在此階段乳清蛋白消化程度不高。經過腸消化后（泳道3、6），25 ℃與95 ℃處理樣品酪蛋白條帶消失，表明酪蛋白消化程度較高；同時，95 ℃處理樣品經過腸消化后，其乳清蛋白條帶比25 ℃處理樣品淺，表明經過95 ℃處理提高了乳清蛋白的消化率。何光華等[20]發現，隨著熱處理溫度的升高，乳清蛋白的消化速率顯著升高，表明熱處理提高了乳清蛋白的消化率。Florence等[21]發現，未加熱脫脂乳中的酪蛋白和β-乳球蛋白對胃消化有較高的抗性，而加熱后β-乳球蛋白對胃消化較敏感。黃俊等[22]將乳清蛋白分別在75、100 ℃濕熱處理后模擬體外消化，發現100 ℃加熱后乳清蛋白的消化率升高。這可能是由于一定程度的熱處理能夠使蛋白質分子結構松散，促使分子內部的側鏈活性基團暴露出來，因此更易被蛋白酶水解。

3 結 論

熱處理改變了MPC70中乳蛋白的表面巰基含量和表面疏水性。在熱處理過程中，當處理溫度高于75 ℃時，乳蛋白的表面巰基含量顯著升高，在95 ℃時達到最高值42.4 μmol/L。表面疏水性也隨著熱處理溫度的升高而升高，同樣在95 ℃時達到最高值。熱處理改變了MPC70中乳蛋白的二級結構。MPC70經過熱處理后，α-螺旋含量降低，β-折疊含量呈現先上升后下降的趨勢，而β-轉角含量呈現先下降后上升的趨勢，無規則卷曲含量呈現先下降后上升的趨勢，且在95 ℃時高于對照組。熱處理明顯改變了MPC70中乳蛋白的消化性，經過95 ℃熱處理的乳蛋白在胃消化過程中消化性降低，但腸消化后蛋白條帶明顯變淺，消化性升高，這與其結構變化相關。