Cullin7表達下調對結腸癌細胞增殖、凋亡的影響

介衛華 趙 彬 李愛紅

河南省漯河市中醫院內三科(462000)

背景：結腸癌為常見的惡性腫瘤之一，發病率和死亡率均較高。Cullin7定位于染色體6p21.1，與惡性腫瘤的發生、發展密切相關。目的：探討Cullin7表達下調對結腸癌細胞增殖、凋亡的影響。方法：采用qRT-PCR和蛋白質印跡法分別檢測結腸癌組織、癌旁組織中Cullin7 mRNA和蛋白表達。以siRNA沉默Cullin7基因，并轉染結腸癌HCT116細胞，qRT-PCR和蛋白質印跡法檢測沉默效果。CCK-8法檢測細胞增殖情況，流式細胞術檢測細胞凋亡情況，蛋白質印跡法檢測cleaved caspase-3、β-catenin、C-myc蛋白表達。以siRNA Cullin7聯合Wnt信號通路抑制劑FH-535處理結腸癌細胞，流式細胞術檢測細胞凋亡情況，蛋白質印跡法檢測cleaved caspase-3、β-catenin、C-myc蛋白表達。結果：結腸癌組織中Cullin7 mRNA和蛋白表達明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)。與對照組相比，siRNA Cullin7 1組、siRNA Cullin7 2組、siRNA Cullin7 3組Cullin7 mRNA和蛋白表達均明顯降低(P<0.05)，尤其是siRNA Cullin7 2組。與對照組相比，沉默Cullin7表達后，結腸癌細胞增殖活性明顯下降，細胞凋亡率明顯增加，cleaved caspase-3蛋白表達明顯上調，β-catenin、C-myc蛋白表達明顯下調(P<0.05)。與siRNA Cullin7 2組相比，聯合Wnt信號通路抑制劑FH-535后，結腸癌細胞凋亡率明顯增加，cleaved caspase-3蛋白表達明顯上調，β-catenin、C-myc蛋白表達明顯下調(P<0.05)。結論：Cullin7基因參與了結腸癌HCT116細胞增殖和凋亡，沉默Cullin7可通過Wnt/β-catenin信號通路抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡。

結腸癌為常見的惡性腫瘤之一，發病率和死亡率均較高，復發和轉移是導致臨床治療失敗的重要原因[1-2]。因此，尋求早期能夠阻斷癌細胞浸潤和轉移的靶向分子，對于結腸癌的臨床治療具有一定意義。Cullin7定位于染色體6p21.1，具有高度保守的Cullin結構域，為泛素連接酶亞基，在多種惡性腫瘤(如乳腺癌、肺癌、肝細胞癌、胰腺癌、卵巢癌等)中高表達，與惡性腫瘤的發生、發展密切相關[3]。已有研究[4]結果表明，與Cullin7低表達的肝癌患者相比，高表達的肝癌患者的預后不良。目前對于Cullin7在結腸癌的發生、進展、浸潤和轉移中的作用尚不明確。本研究采用siRNA沉默結腸癌細胞株中Cullin7表達，并觀察Cullin7在結腸癌細胞增殖、凋亡中的作用，旨在分析其機制，從而為臨床結腸癌的治療提供新的靶點。

材料與方法

一、細胞株和主要試劑

人結腸癌細胞株HCT116(購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，編號TCHu99)。Cullin7 Human siRNA(OriGene Technologies)，其中Cullin7 1-siRNA正義鏈序列：5’-CAA GCA GCA UCA UGA GAA ACC-3’，反義鏈序列：5’-UUU CUC AUG AUG CUG CUU GGA-3’；Cullin7 2-siRNA正義鏈序列：5’-GAG CGA GAA GGA AGA GGA AGC-3’，反義鏈序列：5’-UUC CUC UUC CUU CUC GCU CUU-3’；Cullin7 3-siRNA正義鏈序列：5’-GAU CGA AGA CCA CAG ACG AAC-3’，反義鏈序列：5’-UCG UCU GUG GUC UUC GAU CUG-3’；Cullin7陰性對照正義鏈序列：5’-AGU GAG AAC CGC ACA GAC CAA-3’，反義鏈序列：5’-UCU CUU GGU AUG CGG UCU GUC-3’；脂質體LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)；BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix (2X)(碧云天生物技術研究所)；兔抗人Cullin7、cleaved caspase-3、β-catenin、C-myc蛋白抗體、羊抗兔HRP標記的二抗(碧云天生物技術研究所)；CCK-8試劑盒(碧云天生物技術研究所)；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Wnt信號通路抑制劑FH-535(美國Abcam公司)。

二、方法

1. 組織標本：標本源自2015年1月—2018年1月于河南省漯河市中醫院接受手術治療的15例結腸癌患者，診斷均經病理檢查證實，且術前患者均未接受過化療等相關腫瘤治療。15例結腸癌組織和相應癌旁正常組織(取自距腫瘤邊緣>5 cm處)均于術后30 min內置于液氮罐中凍存。標本使用前均取得患者的知情同意，研究方案通過漯河市中醫院倫理委員會的審批。

2. 細胞培養、轉染和分組：轉染前24 h，取對數生長期細胞并調整細胞密度為1×104個/mL，接種于6孔板。將細胞隨機分為siRNA Cullin7 1組、siRNA Cullin7 2組、siRNA Cullin7 3組、陰性對照組、對照組。加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，每孔2 mL，當細胞達80%以上融合度時，更換為無血清無雙抗的培養基培養。依據LipofectamineTM2000說明書，采用無血清無雙抗培養基分別稀釋LipofectamineTM2000和siRNA(Cullin7 1-siRNA序列、Cullin7 2-siRNA序列、Cullin7 3-siRNA序列、Cullin7陰性對照序列、空載體)至所需濃度，混勻，靜置20 min，加入預先采用無血清無雙抗的培養基培養1 h的細胞中，培養6 h后，更換為完全培養基繼續培養。

3. qRT-PCR法檢測Cullin7 mRNA表達：收集結腸癌及其相應癌旁正常組織以及各組結腸癌細胞，以Trizol試劑提取細胞總RNA，然后反轉錄生成cDNA。采用BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix (2X)試劑盒，選取2 μL cDNA于20 μL反應體系行qRT-PCR。循環條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 25 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。以GAPDH作為內參基因，由上海英駿生物技術有限公司設計引物序列。Cullin7(NM_001168370.1)上游序列：5’-CCT ACC TGA GGG GCA CTT TG-3’，下游：5’-ATC TTG AGG ACC CCT CCT GG -3’，產物大小為187 bp；GAPDH(M17851.1)上游引物：5’-GAG CCA CAT CGC TCA GAA CAC-3’，下游：5’-TCA CAA GCT TCC CGT TCT CA -3’，產物大小為228 bp。采用2-△△Ct法計算目的基因mRNA相對表達水平。

4. 蛋白質印跡法檢測Cullin7蛋白表達：收集結腸癌及其相應癌旁正常組織以及各組結腸癌細胞，常規方法提取蛋白質，調整各樣本蛋白總量，行10% SDS-PAGE電泳，然后轉移至PVDF膜，3% BSA阻斷1 h，加入一抗(1∶1 000)4 ℃過夜，洗膜后添加二抗(1∶3 000)，搖床上搖動1 h，Bio-Rad凝膠成像系統成像拍照，以β-actin蛋白條帶灰度值為內參進行半定量分析。

5. CCK-8法測定細胞活力：取對照組、陰性對照組、siRNA Cullin7 2組細胞并調整細胞密度為1×104個/mL，接種于96孔板，置于37 ℃ 5% CO2培養箱中培養，待細胞融合度達70%～80%時，進行轉染實驗。轉染后12 h、24 h、48 h、72 h，每孔分別加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h后上酶標儀測定450 nm波長處的每孔吸光度(A)值，以空白對照組調零，計算抑制率。

6. 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況：收集轉染48 h的對照組、陰性對照組、siRNA Cullin7 2組細胞，以胰酶消化，1 000×g離心5 min，收集并重懸細胞，1 000×g離心5 min，加入500 μL結合液重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC，然后加入5 μL PI，混勻，室溫孵育10 min，上流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。

7. 蛋白質印跡法檢測各組cleaved caspase-3、β-catenin、C-myc蛋白表達：取對照組、陰性對照組、siRNA Cullin7 2組細胞，采用蛋白質印跡法檢測cleaved caspase-3(工作濃度為1∶2 000)、β-catenin(工作濃度為1∶2 000)、C-myc(工作濃度為1∶3 000)蛋白表達，具體步驟按試劑盒說明書進行操作。

8. Wnt信號通路抑制劑對沉默Cullin7結腸癌細胞增殖、凋亡的影響：取穩定轉染siRNA Cullin7 2組的結腸癌細胞，并分為兩組，其中一組給予正常培養，另一組在培養液中加入終濃度為20 μmol/L的Wnt信號通路抑制劑FH-535。培養24 h后，以流式細胞術檢測細胞凋亡情況，蛋白質印跡法檢測cleaved caspase-3(工作濃度為1∶2 000)、β-catenin(工作濃度為1∶2 000)、C-myc(工作濃度為1∶3 000)蛋白表達。

三、統計學分析

結 果

一、Cullin7在癌旁正常組織和結腸癌組織中的表達

與癌旁正常組織相比，結腸癌組織中Cullin7 mRNA和蛋白表達明顯增加，差異均有統計學意義(P<0.05)(圖1、表1)。

二、siRNA Cullin7下調HCT116細胞中Cullin7的表達

與對照組相比，siRNA Cullin7 1組、siRNA Cullin7 2組、siRNA Cullin7 3組Cullin7 mRNA和蛋白表達均顯著降低(P<0.05)(圖2、表2)，其中siRNA Cullin7 2組下降幅度最大，故后續實驗選擇siRNA Cullin7 2組進行研究。

1：癌旁正常組織；2：結腸癌組織

組 別例數mRNA表達蛋白表達癌旁正常組織150.24±0.020.16±0.04結腸癌組織150.84±0.060.43±0.04t值16.4328.267P值0.0000.001

1：對照組；2：陰性對照組；3：siRNA Cullin7 1組；4：siRNA Cullin7 2組；5：siRNA Cullin7 3組

圖2siRNA Cullin7下調HCT116細胞中Cullin7蛋白表達(蛋白質印跡法)

表2siRNA Cullin7下調HCT116細胞中Cullin7 mRNA和蛋白表達

三、siRNA Cullin7抑制HCT116細胞增殖

對照組、陰性對照組、siRNA Cullin7 2組之間HCT116細胞A值相比差異有統計學意義(F=4.029，P<0.05)；隨著時間延長，三組A值呈增長趨勢，差異有統計學意義(F=95.648，P<0.05)；且處理因素與時間之間存在交互作用(F=2.579，P<0.05)(圖3)。

四、siRNA Cullin7誘導HCT116細胞凋亡

轉染48 h后，對照組、陰性對照組和siRNA Cullin7 2組的細胞凋亡率分別為4.49%±0.03%、5.48%±0.05%、21.38%±0.74%，其中siRNA Cullin7 2組細胞凋亡率明顯高于對照組(P<0.05)(圖4)。

培養時間

五、siRNA Cullin7對HCT116細胞中cleaved caspase-3、β-catenin、C-myc表達的影響

與對照組相比，siRNA Cullin7 2組HCT116細胞中cleaved caspase-3蛋白表達明顯增加，而β-catenin、C-myc蛋白表達明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)(圖5、表3)。

六、抑制Wnt信號通路協同沉默Cullin7對HCT116細胞凋亡的影響

與siRNA Cullin7 2組相比，聯合Wnt信號通路抑制劑FH-535處理后，結腸癌細胞凋亡率明顯增加(36.14%±1.02%對23.92%±0.82%)，差異有統計學意義(P<0.05)(圖6)。

七、抑制Wnt信號通路協同沉默Cullin7對cleaved caspase-3、β-catenin、C-myc表達的影響

與siRNA Cullin7 2組相比，聯合Wnt信號通路抑制劑FH-535處理后，cleaved caspase-3蛋白表達明顯增加，β-catenin、C-myc蛋白表達明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)(圖7、表4)。

討 論

Cullin7為Cullin蛋白家族中較晚開始研究的成員，基因高度保守，其本身并不是促癌基因或抑癌基因，主要通過底物蛋白影響細胞信號通路，并進一步誘導腫瘤的形成[5-6]。有研究顯示，Cullin7在絨毛膜癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤細胞中高表達，為一種致癌基因，與腫瘤的增殖、凋亡、惡性進展等存在一定的聯系，以Cullin7為靶點的藥物和基因治療也引起越來越多的重視[7]。Cullin7過表達在肝細胞癌的發病機制和進展中起有重要作用，可能是肝細胞癌管理的重要標志物，沉默Cullin7可顯著降低肝癌細胞遷移、侵襲和轉移的能力[8]。此外，有研究[9]發現Cullin7高表達與上皮性卵巢癌患者預后不良密切相關，并可下調p53表達，促進卵巢癌細胞增殖和侵襲。Men等[10]發現，Cullin7在肺癌中過表達是肺癌細胞增殖所必需的條件。本研究結果顯示，Cullin7 mRNA和蛋白在結腸癌組織中的表達均明顯高于癌旁正常組織，提示Cullin7表達增高在結腸癌的發生中可能起一定的促進作用。

A：對照組；B：陰性對照組；C：siRNA Cullin7 2組

1：對照組；2：陰性對照組；3：siRNA Cullin7 2組

組 別cleaved caspase-3β-cateninC-myc對照組0.27±0.050.67±0.060.52±0.06陰性對照組0.26±0.070.69±0.050.54±0.05siRNA Cullin7 2組0.43±0.070.31±0.050.37±0.04F值6.65947.86010.090P值0.0300.0000.012

A：siRNA Cullin7 2組；B：siRNA Cullin7 2+FH-535組

1：siRNA Cullin7 2組；2：siRNA Cullin7 2+FH-535組

組 別cleaved caspase-3β-cateninC-mycsiRNA Cullin7 2組0.39±0.050.38±0.050.41±0.06siRNA Cullin7 2+FH-535組0.63±0.060.15±0.030.17±0.04t值5.3226.8325.765P值0.0030.0010.002

RNA干擾主要應用于轉錄后基因表達調控，廣泛用于目前的科學研究。結腸癌是一種常見的惡性腫瘤，其發病原因比較復雜，機制目前尚不明確。因此，尋求一種新的治療靶點對結腸癌的治療、預后具有一定的臨床價值[11]。本研究結果顯示，轉染Cullin7 siRNA 48 h后，結腸癌細胞中Cullin7 mRNA和蛋白表達均明顯低于陰性對照組和對照組，提示siRNA可特異性下調結腸癌HCT116細胞中Cullin7表達。已有研究顯示，Cullin7結構發生改變時，會導致細胞內泛素水平失衡，引起細胞凋亡紊亂，造成惡性增殖[12]。本研究進一步采用CCK-8法檢測轉染Cullin7 2-siRNA后的細胞增殖情況，結果顯示siRNA Cullin7 2組在轉染24 h、48 h和72 h的A值均明顯低于對照組和陰性對照組；流式細胞術示siRNA Cullin7 2組細胞凋亡率明顯高于對照組。提示阻斷Cullin7表達可有效抑制結腸癌HCT116細胞增殖，并誘導細胞凋亡。此外，轉染Cullin7 siRNA后，凋亡蛋白cleaved caspase-3表達顯著增加，表明下調Cullin7表達可通過caspase信號通路誘導結腸癌HCT116細胞凋亡。

Wnt/β-catenin為一種比較保守的信號通路，從低等的果蠅到高等的哺乳動物中均具有高度保守的同源性，與細胞生長、凋亡、黏附存在一定的聯系[13-14]。β-catenin是該經典通路的關鍵蛋白，通過調控包括C-myc等在內的下游靶基因的轉錄和表達影響癌細胞的生長過程[15]。β-catenin在多種惡性腫瘤細胞中過表達，抑制其表達可逆轉惡性腫瘤的表型。潘安萍等[16]的研究發現，沉默β-catenin表達可促進胃癌MGC-803細胞凋亡，阻滯細胞周期，降低細胞侵襲轉移能力，其作用機制可能與影響Wnt/β-catenin信號通路下游靶蛋白表達有關。本研究結果顯示，沉默Cullin7表達后，β-catenin、C-myc表達明顯降低，cleaved caspase-3表達明顯增加；聯合Wnt信號通路抑制劑FH-535后，β-catenin、C-myc表達進一步下調，cleaved caspase-3表達進一步上調，細胞凋亡率明顯增加。提示下調Cullin7表達可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，發揮抑制結腸癌細胞增殖、誘導細胞凋亡的作用。

綜上所述，Cullin7基因參與了結腸癌HCT116細胞增殖和凋亡，沉默Cullin7表達可通過Wnt/β-catenin信號通路抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，表明Cullin7有望成為結腸癌基因治療的新靶點。然而，腫瘤發生、轉移是一個多因素、多階段的復雜過程，涉及多種基因和多種信號傳遞的過程，尚存在許多未知的機制需行進一步研究。

致謝本實驗均在漯河市醫學生物工程重點實驗室完成，在此表示感謝！