基于生物信息學的胃癌核心miRNA篩選和調控網絡分析*

周 荃 孫麗萍

中國醫科大學附屬第一醫院腫瘤病因與篩查研究室 遼寧省高校腫瘤病因與預防重點實驗室(110001)

背景：MicroRNAs(miRNA)是多種真核生物基因表達的負調節因子，在RNA沉默和基因轉錄后調控中發揮作用。幾乎所有類型的惡性腫瘤中均發生miRNA失調，可影響多種基因表達。目的：構建胃癌核心miRNA調控網絡，為解析miRNA在胃癌發生、發展中的分子機制提供理論依據。方法：利用miRNA和mRNA表達譜芯片篩選差異表達miRNA和mRNA，應用miRWalk 2.0預測miRNA相互作用的基因，并與表達譜芯片篩選出的基因進行交叉匹配，確定核心差異表達miRNA，構建miRNA-mRNA調控網絡。對靶基因進行GO分析和KEGG分析。結果：表達譜芯片篩選出21個上調miRNA和36個下調miRNA，交叉匹配后發現1 042個低表達基因和711個高表達基因，最終確定10個核心miRNA-mRNA調控網絡。受核心miRNA調控的差異表達基因主要參與腫瘤相關通路，高表達基因主要富集于ECM-受體作用通路等9個信號通路，而低表達基因主要富集于神經活性配體-受體相互作用等5個信號通路。GO分析結果顯示上調基因涉及315個功能、下調基因涉及88個功能，其中細胞外基質組織的相關性最高。結論：基于生物信息學的miRNA-mRNA調控網絡分析為研究胃癌提供了新的視角，有助于系統性闡明miRNA在胃癌發生、發展中的分子作用機制，可為胃癌診斷標志物的篩選和藥物治療精準靶點的選擇提供理論基礎。

胃癌是全球五大高發腫瘤之一，死亡率居于惡性腫瘤前三位，東亞和東歐是胃癌最高發地區[1]。2012年統計數據顯示，我國胃癌新發病例約為42.4萬例，死亡病例約為29.8萬例[2]。對胃癌發生、發展過程中分子機制的研究，有助于揭示胃癌的發病機制、篩選胃癌診斷標志物和選擇藥物治療精準靶點，從而降低胃癌死亡率。

MicroRNAs(miRNA)是一種存在植物、動物和某些病毒中的非編碼RNA分子，由較大的轉錄物加工成發夾前體，再由RNase Ⅲ酶家族成員Drosha和Dicer依次發揮作用，產生成熟、大小為20～22個核苷酸的miRNA。MiRNA是多種真核生物基因表達的負調節因子，通過堿基配對與mRNA分子內的互補序列相互作用，在RNA沉默和基因的轉錄后調控中發揮作用[3]。此外，miRNA在生物樣品中具有高穩定性的特點，因此有望成為未來生物學標志物研究領域的熱點[4-5]。研究表明，幾乎所有類型的惡性腫瘤中均可發生miRNA失調[6-7]，可影響多種基因的表達。

近年來，越來越多的研究涉及miRNA在胃癌中的調控作用，但尚缺乏從miRNA-mRNA調控網絡全局的角度分析miRNA功能的報道。對胃癌相關miRNA-mRNA網絡系統進行整合分析，有助于全面解析miRNA在胃癌發生、發展中的生物學功能。本研究擬利用miRNA和mRNA表達譜芯片公共數據庫，篩選在胃癌中存在差異表達的miRNA和mRNA；進一步通過預測和交叉比對分析miRNA-mRNA內在聯系，構建胃癌核心miRNA的分子調控網絡，并通過富集分析闡明miRNA調控途徑和預測其作用機制，進而為解析胃癌發病機制提供有價值的理論依據。

材料與方法

一、微陣列數據

本研究所使用的miRNA芯片(GSE23739)和mRNA表達譜芯片(GSE13911)均來自于美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)的基因表達數據庫(Gene Expression Omnibus, GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。其中，miRNA芯片包括40對胃癌組織及其配對的癌旁正常組織，mRNA表達譜芯片包括38例胃癌組織和31例癌旁正常組織。

二、數據處理

使用R語言進行數據處理和統計學分析。利用GEOquery包中getGEO函數下載miRNA芯片(GSE23739)和mRNA表達譜芯片(GSE13911)的原始數據，然后以exprs函數提取表達數據。使用normalizeBetweenArrays函數對數據進行標準化處理。利用limma程序包中model.matrix函數定義分組，lmFit、contrasts.fit、eBayes等函數分析胃癌組織和正常胃黏膜組織中差異表達的miRNA和mRNA。以|logFC|>1且P<0.05作為閾值，篩選差異表達的miRNA和mRNA。ggplot2程序包中的ggplot和geompoint函數用于繪制表達火山圖。

三、miRNA調控網絡的構建

應用miRWalk 2.0數據庫(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/)預測差異miRNA的靶基因?？紤]到miRNA對于基因的負向調控性，本研究將高表達miRNA預測到的靶基因與胃癌差異表達中的低表達基因進行交叉匹配；反之，將低表達miRNA預測到的靶基因與高表達基因進行交叉匹配。結果采用Cytoscape 3.6.0軟件進行呈現。

四、功能注釋分析和富集分析

對胃癌中差異表達miRNA調控的靶基因行GO(Gene Ontology)分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析。使用R語言ClusterProfiler程序包中的enrichGO和enrichKEGG函數，對差異表達基因進行GO分析和KEGG富集分析，設定參數“pAdjustMethod=“BH”，pvalueCutoff=0.05，qvalueCutoff=0.2”。Z值的P<0.05為差異有統計學意義。利用ggplot2程序包對差異顯著的前12個結果進行可視化。

結 果

一、差異表達miRNA和mRNA的篩選

MiRNA芯片(GSE23739)中篩選出56個胃癌差異表達miRNA(上調20個，下調36個)，mRNA表達譜芯片(GSE13911)中篩選出3 289個胃癌差異表達基因(上調994個，下調2 295個)(表1、圖1)。

表1 胃癌差異表達miRNA

圖1 胃癌差異表達miRNA和mRNA芯片篩選

二、核心miRNA調控網絡的構建

通過miRWalk 2.0數據集篩選和交叉匹配，發現1 753個受胃癌差異表達miRNA調控的基因，包括1 042個低表達基因和711個高表達基因。將與差異基因相互作用數量位列前五位的miRNA定義為核心miRNA，高表達基因的核心miRNA分別為hsa-miR-17-5p(175個)、hsa-miR-20a-5p(100個)、hsa-miR-20b-5p(174個)、hsa-miR-7-5p(97個)、hsa-miR-96-3p(96個)(圖2)；低表達基因的核心miRNA分別為hsa-miR-650(82個)、hsa-miR-513b-3p(81個)、hsa-miR-603(74個)、hsa-miR-494-3p(67個)、hsa-miR-513c-3p(66個)(圖3)。

三、miRNA調控基因的KEGG富集分析

對胃癌差異表達miRNA調控的差異基因進行KEGG通路富集分析。1 753個差異基因被富集到多個腫瘤相關的通路，其中高表達基因主要富集于下列9個通路：ECM受體作用通路(ECM-receptor interaction)、細胞周期(cell cycle)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、p53信號通路(p53 signaling pathway)、糖尿病并發癥AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、黏著斑(focal adhesion)、小細胞肺癌(small cell lung cancer)、人乳頭瘤病毒感染(human papilloma virus infection)和蛋白質消化吸收(protein digestion and absorption)。而低表達基因主要富集在神經活性配體-受體相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、膽汁分泌(bile secretion)、鈣信號通路(calcium signaling pathway)、視黃醇代謝(retinol metabolism)、胃酸分泌(gastric acid secretion)等通路(表2)。

圖2 胃癌高表達基因的核心miRNA調控網絡

圖3 胃癌低表達基因的核心miRNA調控網絡

表2 胃癌差異miRNA調控基因的KEGG通路富集分析

上述通路中，與腫瘤細胞增殖相關的通路包括細胞周期和PI3K-Akt信號通路；參與腫瘤轉移和侵襲的通路包括ECM-受體相互作用、黏著斑和鈣信號通路；影響腫瘤細胞凋亡的通路為PI3K-Akt信號通路；p53信號通路涉及多種腫瘤細胞生物學行為。

四、miRNA調控基因的GO分析

對胃癌差異表達miRNA調控的差異基因進行GO分析，上調基因涉及315個功能、下調基因涉及88個功能，按P值由小到大排序，依次為細胞外基質組織(extracellular matrix organization)、細胞外結構組織(extracellular structure organization)、染色體分離(chromosome segregation)、姐妹染色單體分離(sister chromatid segregation)、膠原分解代謝過程(collagen catabolic process)、核染色體分離(nuclear chromosome segregation)、核分裂(nuclear division)、細胞器裂變(organelle fission)、紡錘體(spindle)、染色體著絲粒區域(chromosome centromeric region)，以及調節激素水平(regulation of hormone levels)、胰島素分泌(insulin secretion)、金屬離子跨膜轉運蛋白活性(metal ion transmembrane transporter activity)、肽激素分泌(peptide hormone secretion)、調節肽激素分泌(regulation of peptide hormone secretion)、調節胰島素分泌(regulation of insulin secretion)、激素運輸(hormone transport)、調節膜電位(regulation of mem-brane potential)、激素分泌(hormone secretion)、調節激素分泌(regulation of hormone secretion)(圖4)。

討 論

成熟的miRNA分子主要在細胞質中與mRNA的3’-UTR結合，少數可與啟動子區、編碼區或5’-UTR結合，通過募集AGO蛋白組裝成沉默復合體(RISC)后，經由兩種途徑負向調控靶基因。其一，miRNA可與靶基因3’-UTR不完全互補結合，抑制靶基因mRNA翻譯，但不影響其穩定性；其二，miRNA可與靶基因3’-UTR完全互補結合，引起靶基因mRNA的切割降解。本研究從miRNA作用機制入手，篩選以胃癌異常表達的miRNA為中心的mRNA調控網絡，進一步通過功能和通路富集分析探討miRNA在胃癌中的分子調控功能和信號通路，從而為解析miRNA在胃癌發生、發展中的分子機制提供有價值的理論基礎。

通過生物信息學篩選，本研究確定了10個核心miRNA，包括5個上調miRNA(hsa-miR-17-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-96-3p)和5個下調miRNA(hsa-miR-650、hsa-miR-513b-3p、hsa-miR-603、hsa-miR-494-3p、hsa-miR-513c-3p)，其中hsa-miR-17-5p調控的靶基因最多。目前研究發現，hsa-miR-17-5p、hsa-miR-20a-5p和hsa-miR-650與胃癌的發病風險相關[8-10]，hsa-miR-17-5p和hsa-miR-20a-5p與胃癌的療效和預后相關，而hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-96-3p、hsa-miR-513b-3p，hsa-miR-603和hsa-miR-494-3p的作用尚不清楚，有待進一步研究。

研究報道，hsa-miR-17-5p通過調節細胞周期相關基因(包括GAB1、MAPK9、MYCN、PKD1、PKD2、RBL1、TSG101、NCOA3等)影響腫瘤細胞的增殖過程[11]。胃癌患者血液和胃癌組織中hsa-miR-20a-5p表達顯著上調[9]，血清hsa-miR-17-5p可作為胃癌的預警標志物[8]。本研究結果提示，hsa-miR-17-5p為影響胃癌細胞增殖的關鍵miRNA，可調控靶基因MYCN表達。此外，hsa-miR-17-5p和hsa-miR-20a分別通過靶向p21和NFKBIB基因誘導胃癌細胞對DDP的耐藥性[12-13]，hsa-miR-17-5p高表達的胃癌患者更易發生淋巴結轉移[14]，總體存活率較差[8]。上述研究結果提示hsa-miR-17-5p和hsa-miR-20a-5p可作為胃癌預后和療效的靶點。

圖4 miRNA調控基因GO功能注釋

目前認為hsa-miR-650的生物學效應在多種腫瘤中的表現并不一致。非轉移性結直腸癌中，hsa-miR-650通過靶向AKT2抑制AKT途徑的激活，進而抑制腫瘤增殖和侵襲[15]。hsa-miR-650在前列腺癌中高表達，通過抑制CSR1促進前列腺癌細胞增殖[16]。另有研究[10,17]發現，hsa-miR-650通過靶向ING4促進胃癌和肝癌細胞增殖。Lario等[18]的報道顯示，幽門螺桿菌(Hp)陽性患者胃黏膜組織中hsa-miR-650高表達，提示hsa-miR-650可能參與Hp感染導致的胃黏膜癌變過程。

研究發現，hsa-miR-7-5p可能作為腫瘤抑制因子在乳腺癌[19]、膠質瘤[20]、頭頸部腫瘤[21]、肝癌[22]、結腸癌[23]等多種腫瘤中發揮作用，可通過靶向IRS2基因激活Akt信號通路[24]，或通過抑制RelA/NF-κB通路減少腫瘤細胞增殖和轉移[25]。但hsa-miR-7-5p在胃癌中的生物學功能尚不清楚。本研究結果顯示hsa-miR-7-5p是一個原癌基因，提示其在胃癌中的調控作用異于其他腫瘤，這可能是因為miRNA作為非編碼RNA，主要是通過調控不同的靶基因來影響腫瘤的發生、發展。

對于miRNA調控下游基因來影響胃癌發生的關鍵機制，目前尚不十分清楚，miRNA-mRNA調控網絡可為解析miRNA在胃癌中的作用提供可參考的研究方向。

KEGG通路富集分析結果表明，胃癌差異表達miRNA富集的信號通路涉及胃癌發生、發展的全過程。細胞周期是腫瘤發生的核心過程，包括細胞增殖和細胞分裂。細胞周期和PI3K-Akt信號通路與細胞增殖密切相關，PI3K/AKT/mTOR通路可影響細胞周期，抑制多種原因引起的細胞凋亡，促進血管形成，參與胃癌侵襲和轉移[26]。ECM-受體相互作用、黏著斑和鈣信號通路是影響腫瘤細胞轉移和侵襲的重要通路；腫瘤細胞與ECM組分，如層黏連蛋白、纖維連接蛋白和膠原蛋白的相互作用在腫瘤侵襲和轉移中起關鍵作用，且黏附受體能促進這種相互作用[27]。P53信號通路與多種腫瘤細胞生物學行為相關，不僅可與PI3K-Akt信號通路相互作用影響胃癌細胞增殖，還可調控黏附力通路促進胃癌細胞轉移[28]。胃酸分泌與胃癌發生密切相關，有文獻報道小鼠體內低胃酸分泌會導致慢性炎癥、胃壁萎縮、壁細胞功能喪失以及促進腫瘤生長等一系列過程[29]，而Hp感染相關的低胃酸分泌在Hp致胃癌中亦起有關鍵作用[30]。由此可見，胃癌差異表達miRNA能通過調控多個信號通路的靶基因來影響胃癌的發生及其生物學行為。

GO功能注釋分析結果提示，miRNA調控的基因主要與染色體調控功能、激素分泌功能等相關。流行病學調查顯示男性胃癌的發病率為女性的兩倍[31]。一項關于性激素與胃癌發病風險的meta分析顯示雌激素可明顯降低胃癌的發病風險[32]。提示miRNA能通過影響細胞周期和細胞分裂來調節人體激素水平，進而影響胃癌的發生。

綜上所述，本研究利用生物信息學分析方法對胃癌中差異表達的miRNA進行系統篩選和歸納總結，構建了miRNA-mRNA共表達網絡，并進一步對下游調控mRNA進行了功能分析和通路分析，全面解析了胃癌中miRNA的調控作用及其可能機制。本研究結果為闡明miRNA在胃癌發生、發展中的分子機制提供了有價值的參考，為胃癌診斷標志物的篩選和藥物治療精準靶點的選擇提供了理論基礎。