結腸癌SAE2表達水平與臨床病理特征及預后的相關性

劉昭詩，賴人旭*，任江南，麥蕾，高敏照

(1中山大學附屬第五醫院消化內鏡中心，珠海 519000; 2中山大學附屬第五醫院消化內科，珠海 519000)

結直腸癌在全球惡性腫瘤中發病率位居第三，死亡率位居第五[1]。隨著經濟的發展和生活方式的改變，我國結直腸癌的發病率及病死率均上升至惡性腫瘤的前五位[2]。小泛素相關修飾物（small ubiquitin-like modi fier，SUMO）修飾作為蛋白質翻譯后修飾的一種，遍及體內細胞代謝的眾多過程[3],在細胞離子通道和信號轉導的調控、細胞遷移和凋亡中，SUMO發揮著重要的作用[4]。SAE2是SUMO化激活酶E1的亞基之一[5]，其異常表達可導致SUMO化途徑的失調。研究表明，SAE2的表達水平與多種腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲有著密切的關系，但有關其與結腸癌關系的研究較少。本文回顧性分析了93例結腸癌組織及相對應的71例癌旁正常組織中SAE2的表達情況，并進一步探討其與結腸癌患者臨床病理特征及預后之間的關系。

材料與方法

1 研究對象

收集2010年1月至2014年12月在中山大學附屬第五醫院就診并接受手術治療的164例結腸病理組織（其中結腸癌組織標本93例，相對應的癌旁正常組織標本71例，22例結腸癌病例無癌旁組織），所有結腸癌組織經病理證實為R0切除（即手術切緣鏡下觀察陰性）。納入標準包括手術切除的腫瘤病灶、經手術病理證實為原發性結腸癌、具有完整臨床資料、無術前放療和化療等治療。排除標準包括原位癌（高級別上皮內瘤變）、直腸及盲腸和肛管惡性腫瘤、結腸轉移性癌、同時存在其他部位原發惡性腫瘤、遺傳性非息肉病性結腸癌。

2 病例臨床特征

結腸癌患者醫療記錄內容包括：社會人口學特征如年齡、性別等；臨床病理資料如腫瘤部位、腫瘤直徑、病理類型、分化程度、腸壁浸潤深度、淋巴結轉移情況、遠處轉移情況、術后有無放化療等。腫瘤病理分期標準：采取美國癌癥聯合委員會或國際聯合抗癌委員會（UICC/AJCC）的結腸癌（第七版）TNM分期系統進行結腸癌病理分期。解剖分布根據國際標準的第三版腫瘤分類法分為3組：右半結腸（包括升結腸、結腸肝曲、橫結腸）組、左半結腸（包括結腸脾曲、降結腸、乙狀結腸）組、其他（跨越多個腸段等）組。

3 免疫組織化學染色

采用免疫組織化學PV-6000二步法檢測SAE2的表達，所使用的第一抗體為兔抗人SAE2多克隆抗體（1:100；Abcam公司，ab58451），以PBS溶液代替一抗作為陰性對照，以抗體說明書指示的肺腺癌組織（SAE2表達陽性）作為陽性對照。實驗結果以細胞核或細胞質出現棕褐色的強度和面積作為SAE2蛋白表達程度的判斷標準分為4級：無染色或染色面積＜10%為SAE2（0）；染色模糊且可見染色面積大于10%為SAE2（1+）；中等染色面積大于10%為SAE2（2+）；強染色面積大于10%為SAE2（3+）（由兩名病理醫生雙盲法10倍物鏡下隨機觀察10個視野；SAE2 0～1+為表達陰性表達，SAE2 2+～3+為表達陽性表達）。

4 隨訪記錄

隨訪資料記錄內容：隨訪起始時間為手術治療日期；隨訪截止日期為2018年2月28日；終點事件是患者的主要死因為結腸癌轉移、復發或結腸癌相關并發癥；完全數據是指隨訪起始至終點事件出現；生存時間均以月為單位記錄。計算病人1年、3年和5年生存率，如果病人生存時間超過1年，則將截斷時間定義為1年；若病人因非腫瘤因素導致死亡或中途失訪，生存時間即為截斷時間；如果病人生存時間短于1年，則為發生終點事件。3年和5年生存率以此類推。

5 統計學方法

應用SPSS 22.0軟件進行統計分析，SAE2的組間表達的差異比較應用分類變量的χ2檢驗；臨床病理因素應用Kaplan-Meier單因素生存分析、Log-Rank法檢驗；應用 Cox 回歸比例風險模型篩選影響結腸癌患者生存預后的獨立危險因素。所有統計檢驗均為雙側檢驗，檢驗水準為α=0.05，P＜0.05視為差異有統計學意義。

結 果

1 SAE2在結腸癌組織中高表達

SAE2在93例結腸癌標本中34例為陽性表達，59例為陰性表達，陽性表達率為36.6%（34/93）；在71例癌旁正常結腸標本中2例為陽性表達，69例為陰性表達，陽性表達率為2.8%（2/71）。將結腸癌組織與癌旁正常組織鏡下觀察結果對比顯示：SAE2表達水平在結腸癌組織標本中較癌旁正常組織標本高，差異具有統計學意義（χ2=26.756，P＜0.001）（圖 1和表1）。

2 SAE2表達水平與結腸癌臨床病理因素相關

SAE2陽性表達率在不同性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、浸潤深度、分化程度、病理類型中，差異無統計學意義（均P＞0.05）。不同Dukes分期中，C+D期者SAE2陽性表達率為53.5%，A+B期者為22.0%，其差異具有統計學意義（χ2=12.956，P＜0.001）。不同TNM分期中，SAE2陽性表達率在I期、II期、III期、IV期分別為0%、29.4%、32.4%、38.2%，差異具有統計學意義（χ2=11.480，P＜0.05）。SAE2陽性表達率在有淋巴結轉移者為51.4%，無淋巴結轉移者為27.6%，差異具有統計學意義（χ2=5.350，P＜0.05）。SAE2陽性表達率在有發生遠處轉移者為68.4%，無遠處轉移者為28.4%，差異具有統計學意義（χ2=10.452，P＜0.001）（表2）。

圖1 SAE2在結腸/結腸癌組織中的表達。A，陰性對照組；B，陽性對照組；C，SAE2(0)；D，SAE(1+)；E，SAE(2+)；F，SAE(3+)；比例尺，20μmFig.1 Expression of SAE2 in normal colon/colon cancer tissue. A, negative control；B, positive control；C, SAE2(0)；D, SAE(1+)；E, SAE(2+)；F,SAE(3+); scale bar, 20μm

表1 SAE2在結腸癌和癌旁正常組織的表達Tab. 1 The expression of SAE2 in colon cancer and adjacent normal tissues

表2 SAE2與結腸癌臨床病理因素的關系Tab. 2 Relationship between SAE2 and clinicopathological factors of colon cancer

3 SAE2表達水平與結腸癌患者預后相關

進行隨訪的93例結腸癌患者中，最短隨訪時間為0個月，最長隨訪時間為95個月，中位隨訪時間為41.0個月，平均隨訪時間為40.73個月，中位生存時間為26.00個月。直至2018年2月28日隨訪停止時，有65個受訪者仍然存活。生存期超過5年的有24例，占患者總數的25.8%。有29例發生死亡，其中有28例死于結腸癌所致的復發或轉移、并發癥等，另有1例為因其他疾病死亡。有6名受訪者在發生了復發或遠處轉移后，直到隨訪截止時仍然存活。

低年齡組1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為98%、86%、76%，而高年齡組1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為80%、54%、52%，差異具有統計學意義（P＜0.05）。Dukes分期為A+B期者1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為98%、93%、90%，C+D期者1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為81%、45%、32%，差異具有統計學意義（P＜0.001）。TNM分期為I期者5年生存率達100%，II期、III期、IV期者1年生存率分別為100%、94%、67%，3年生存率85%、69%、26%，5年生存率71%、69%、7%，差異具有統計學意義（P＜0.001）。腫瘤浸潤深度為T1+T2期、T3期、T4期1年生存率分別為100%、96%、76%，2年生存率分別為80%、82%、49%，5年生存率分別為80%、76%、35%，差異具有統計學意義（P＜0.05）。無淋巴結轉移組患者1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為98%、86%、80%，有淋巴結轉移組患者1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為77%、48%、36%，較無淋巴結轉移組的生存率下降，以5年生存率下降最為顯著，差異具有統計學意義（P＜0.001）。無遠處轉移患者1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為90%、83%、68%，而有遠處轉移組患者生存率明顯下降，其1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為30%、10%、10%，其差異具有統計學意義（P＜0.001）。SAE2表達陰性者1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為96%、86%、80%， SAE2表達陽性者1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為81%、50%、41%，5年生存率降低更為明顯，其差異具有統計學差異（P＜0.001）（表3和圖2）

4 SAE2是結腸癌患者生存時間的獨立影響因素

將單因素分析所得具有統計學意義的因素納入Cox多元回歸模型表4所示，不同Dukes分期、不同浸潤深度、有無淋巴結轉移和有無遠處轉移對生存時間影響的差異無統計學意義（均P＞0.05）。SAE2表達陽性者較陰性者死亡風險升高（P＜0.05）。高年齡組較低年齡組死亡風險升高（P＜0.05）。高TNM分期者較低TNM分期者死亡風險升高（P＜0.05）（表4）。

表3結腸癌患者預后的單因素分析Tab.3 Univariate analysis of prognosis in patients with colon cancer

討 論

研究表明，SAE2的表達水平與多種腫瘤細胞如骨肉瘤細胞、乳腺癌、肝癌細胞、膽管癌、肺癌等的增殖、遷移和侵襲有著密切的關系[6-11]，且SAE2的表達水平與腫瘤的TNM分期和腫瘤分化程度相關[12]，同時與患者的生存預后成一定相關性，但與結腸癌關系尚不十分明確。本實驗應用免疫組化法對164例結腸組織標本中SAE2的表達水平進行檢測，結果發現93例結腸癌標本中陽性表達率達到36.6%（34/93），而在71例對應的癌旁正常標本中陽性表達率僅為2.8%（2/71），結腸癌組織中SAE2的陽性表達率明顯高于癌旁正常組織。實驗結果表明SAE2在結腸癌組織中高表達，提示著SAE2可能是結腸上皮細胞發生惡變的重要環節，有望成為結腸癌診斷和治療的靶標。

圖2 結腸癌患者生存狀況的Kaplan-Meier單因素分析Fig. 2 Kaplan-Meier univariate analysis of survival status of colon cancer patients

表4 影響患者預后的Cox多元回歸分析Table 4 Cox multivariate regression analysis of prognosis in patients

在Shao[13]的研究中，SAE2的表達與腫瘤浸潤的深度、是否發生遠處轉移、患者的TNM分期有著明顯的相關性，胃癌細胞的增殖和轉移潛力在敲除SAE2降低其表達后得到減弱。而在Liu[11]課題組中，實驗表明降低SAE2的表達后，不僅可以延緩肺癌細胞的生長、增加其凋亡的發生，還可降低腫瘤的遷移能力和侵襲性。Cheng[14]和Ji[15]的研究結果顯示，SAE2可能通過Wnt/β-catenin信號通路影響結直腸癌或胃癌腫瘤細胞的侵襲性和遷移。以上結果均表明SAE2與腫瘤的發生和侵襲性密切相關，但目前國內外對SAE2與結腸癌發生、發展的關系研究較少且不深入。在本研究中，93例隨訪對象被按年齡、性別、Dukes分期、TNM分期、腫瘤部位及大小、浸潤深度、分化程度、病理類型等分為不同亞組。通過統計學方法對不同亞組中結腸癌患者臨床病理資料以及SAE2的表達水平進行分析后結果顯示：SAE2在結腸癌組織中的表達水平與患者的性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、浸潤深度、分化程度、病理類型無關，與患者的Dukes分期、TNM分期、是否發生淋巴結或遠處轉移有關?；颊叩腄ukes分期越晚，SAE2陽性表達率越高，C+D期的患者SAE2陽性表達率高于A+B期。同時，隨著TNM分期增加SAE2陽性表達率也在增加，I期、II期、III期、IV期患者的SAE2陽性表達率呈現遞增趨勢（I期為0%、II期為29.4%、III期為32.4%、IV期為38.2%），IV期的陽性表達率最高，顯著高于陽性率為0%的I期患者。SAE2的陽性表達率在有淋巴結轉移或遠處轉移的患者中顯著高于無淋巴結或遠處轉移的患者。在腫瘤浸潤深度上，SAE2的陽性表達率隨著浸潤深度的增加呈現上升的趨勢，T1+T2中SAE2陽性率為16.7%，T3中SAE2陽性率為33.9%，T4中SAE2陽性率為48.0%，但各組間差異無統計學意義，考慮與所收集的組織標本主要集中在T3分期導致的組間分布不均對結果造成了一定的偏倚有關。SAE2與腫瘤的臨床分期以及轉移情況密切相關，提示SAE2的高表達可能在結腸癌的發生、發展、侵襲過程起著促進的作用，其異常不僅提示著腫瘤的存在，同時還可能反映腫瘤發展、浸潤的程度，其可以預測結腸癌的轉移情況，與前述研究發現具有一致性。

在本研究單因素分析中，患者的生存時間與年齡、Dukes分期、TNM分期、腫瘤浸潤深度、有無淋巴結核轉移或遠處轉移以及SAE2在結腸癌中的表達水平有關，與分化程度、病理類型、術后有無放化療等無關。通過建立Cox多元回歸模型分析得知年齡、TNM分期以及SAE2在腫瘤組織的表達水平是影響患者生存預后的獨立危險因素。SAE2是結腸癌患者生存時間的獨立影響因素，且其表達與腫瘤Dukes分期、TNM分期浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移相關，預示其在評估結腸癌的轉移情況、判斷預后存在潛在價值，可作為判斷結腸癌進展情況以及生存預后的一個重要標志物。

本研究屬于回顧性研究，結腸癌患者部分資料，如患者其他感染情況、手術方式和治療記錄等情況登記不完整，故未對其與結腸癌患者總體生存期進行統計分析。另外，部分結腸癌患者的失訪也造成了一定的信息偏倚。

綜上所述，SAE2與結腸癌的發生、侵襲性以及預后密切相關，在結腸癌患者的診治中結合TNM分期加入SAE2的檢測，或許可使結腸癌診治更具有客觀性和個體化。