Hippo信號通路在腫瘤免疫中的作用

陳慶，朱安平，李正平，王媛，殷焦*，沈關心

（1中國人民解放軍聯勤保障部隊第991醫院 441010；2湖北文理學院醫學院 襄陽 441053；3華中科技大學同濟醫學院免疫學系 武漢，430030）

Hippo通路最早在果蠅研究中被發現，主要通過調控細胞的增殖和凋亡，進而控制組織器官生長體積的大小。Hippo通路相關的信號分子亦參與免疫應答反應，在哺乳動物中發揮免疫調節作用等。近年研究發現Hippo信號通路與腫瘤的發生密切相關，成為新的研究熱點。Hippo通路在腫瘤的發生中發揮至關重要作用，推測其功能障礙可能是腫瘤發生的初始因素之一。本文就Hippo通路相關信號分子在腫瘤免疫中的作用進行綜述，旨在深入了解Hippo通路的重要功能，為其作為臨床研究抗腫瘤的潛在靶點提供依據。

1 保守的Hippo信號通路

Hippo通路是組織器官體積大小的保守信號通路，同時還可以調節多種生物學功能，包括細胞生長、控制組織器官體積大小，以及干細胞的自我更新等[1,2]。

在果蠅研究中鑒定的Hippo通路有4個主要激酶 成 分：Hippo（Hpo）、Salvador（Sav）、Warts（Wts）和Mob腫瘤抑制因子（Mats）；其中任何一個成分失活都會促進細胞生長和抑制凋亡，導致細胞無限制增殖。Hpo-Sav形成復合體通過磷酸化Wts-Mats復合體而激活腫瘤抑制通路，有效控制細胞的增殖。果蠅體內Hippo通路的核心是Yorkie （Yki）蛋白，Yki激活后會發生Hpo/Sav-Wts/Mats軸失去效應，導致細胞的大規模增殖[3]；Hpo-sav誘導的Wts磷酸化，繼而引起Yki磷酸化，磷酸化Yki增加，滯留在細胞質而無法進入細胞核，使細胞分裂增殖被抑制。

在哺乳動物，Hippo通路每個激酶成分對應的信號分子分別是：MST1/2對應Hpo，SAV1對應Sav，LATS1/2對應Wts，MOB1對應Mats，Hippo信號通路由這4個主要的激酶調控Yes相關蛋白 （Yes-associated protein, Yap）及其旁系同源蛋白TAZ的活性。Yap和TAZ在哺乳動物為腫瘤蛋白，與果蠅的Yki是同源蛋白。

當Hippo通路激活后引起Mst 1/2 活化，與支架蛋白Savl組成復合物使Lats1/2 （large tumor suppressor ; LATS）激酶磷酸化并被激活，與另一支架蛋白Mob1組成復合物，直接使Yap蛋白上S127被磷酸化后產生一個14-3-3的結合基序，與胞漿中的14-3-3蛋白結合而滯留在胞漿中，或進一步被磷酸化后通過蛋白酶體途徑被降解[3]。

非磷酸化狀態的Yap進入細胞核后，與轉錄因子結合，發揮其生物學作用。目前公認的轉錄因子是TEA-domain （TEAD）和p73。核內Yap/TAZ與TEAD結合，促進或抑制TEAD靶基因的表達，如CTGF（connective tissue growth factor，結締組織生長因子）和Cyr61（cysteine-rich protein 61, 富半胱氨酸肝素結合蛋白61），調節多種生物學功能。例如，發生細胞接觸抑制，即當細胞密集接觸時，Hippo通路活化，Yap/TAZ磷酸化水平增加、與細胞核隔離，其細胞增殖作用消失；細胞分離時，Hippo通路失活、促進Yap/TAZ遷移至細胞核引導細胞的分裂增殖[4]。Yap/TAZ 是Hippo通路主要的轉錄輔激活因子，其在細胞核與細胞質之間的位置轉移決定Hippo是否被有效激活。

2 Hippo-Yap信號通路與腫瘤免疫

炎癥反應的微環境誘導發生有害的突變，使機體發生各類腫瘤的機率大大增加。微環境中的免疫細胞和腫瘤細胞之間一直都在發生相互作用。

研究報道[5]在多種腫瘤組織中發現核內Yap的表達增高，Yap的活性與腫瘤的發生和發展密切相關，腫瘤發生的每個階段都有過量Yap激活，因此Yap被確定為腫瘤蛋白，與Hippo-Yap通路功能障礙相關所發生的腫瘤稱為Yap依賴的腫瘤（Yap-independent cancer）。Hippo通過調控下游蛋白Yap的表達影響腫瘤發生與發展。體外實驗報道Hippo信號通路功能失調的肝細胞會發展成惡性腫瘤。

2.1 Hippo-Yap通路與TIC募集巨噬細胞相關

腫瘤發生最初階段是以單個腫瘤啟動細胞（tumor-initiating cell,TIC）存在的時期，活化狀態的Yap有助于TIC募集巨噬細胞保護腫瘤細胞、使之免于免疫清除。

正常情況下，TIC微環境中的炎性細胞因子以及IFN等促進樹突狀細胞成熟、活化以及抗原交叉呈遞，擴大并活化效應性CD8＋T細胞克隆，從而確保免疫監視及免疫清除。最近研究[6]發現肝細胞MST1/2缺失會引起相關的Yap過表達，直接并顯著增強肝細胞分泌單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein，MCP-1），促進巨噬細胞大量浸潤（圖1a），M1和M2表型混雜。動物實驗中證明，轉基因表達過量Yap蛋白，沉默MST1/2或敲除SAV1的小鼠發生肝臟腫大，并最終致肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）發生發展。Yap的去除可抑制MST1/2-dko小鼠MCP1表達，恢復正常的肝臟生長。MCP1是肝細胞中Yap的直接轉錄靶點，在人肝癌中Yap靶點和MCP-1之間存在強基因表達相關性；肝細胞中的Hippo信號通過抑制Yap依賴的MCP1表達，抑制腫瘤前微環境形成過程中巨噬細胞的浸潤，維持正常的肝臟生長抑制HCC增殖，為治療肝癌提供了新的靶點[6]。

趙斌課題組研究發現肝細胞中Yap的激活誘導集落刺激因子1（colony stimulating Factor，CSF-1）和C-C Motif趨化因子配體2（C-C Motif Chemokine Ligand 2，CCL2）兩個趨化因子的表達，招募M2型巨噬細胞至TIC周圍（圖1b），抑制效應T細胞，促使TIC逃逸免疫監視，避免被清除[7]。因此盡管炎癥局部微環境中發生著免疫反應，對于癌細胞卻依然如“培養基”般使之“茁壯成長”。Hippo通路的激活抑制Yap-TEAD復合物形成，抑制TIC相關巨噬細胞的招募，減少釋放對TIC有保護作用的分子，有助于腫瘤殺傷細胞更加有效的發揮作用。這項研究首次證明巨噬細胞在體內單個TIC的存活中起著決定性作用并為通過靶向Yap或巨噬細胞消除TIC提供了原理證明。

Treg細胞的聚集也在TIC的微環境中介導腫瘤細胞的免疫逃逸。研究發現胃腺癌中Hippo通路成分Lats2、Yap的表達與浸潤性Treg細胞計數以及腫瘤Foxp3的表達正相關。Hippo通路通過磷酸化Yap，減少浸潤性Treg細胞數量并降低其活性，有助于機體的抗腫瘤免疫，抑制TIC增殖[8]。

2.2 Hippo通路與MDSCs相關

腫瘤細胞最初成功的免疫逃逸導致腫瘤的繼續發展，與此同時機體針對腫瘤組織發生免疫細胞的浸潤；一部分細胞發揮監視并清除突變細胞的功能，另一部分以髓源性抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）為代表的免疫細胞則促進機體產生免疫耐受反應。在有關前列腺癌的研究中發現抑制Hippo通路，Yap-TEAD復合物形成增加，進而上調MDSCs的趨化因子CXCL5的分泌[9]，促進腫瘤細胞微環境中表達趨化因子受體CXCR2的MDSCs的募集，抑制免疫系統對腫瘤細胞的清除（圖1c）。Murakami等隨后在胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）小鼠模型研究中發現類似結果，且與臨床中觀察到的PDAC數據一致[10]。Sarkar等在高分化漿液性卵巢癌小鼠模型研究中還發現Yap作用于腫瘤基因PRKCI，進而上調腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor ，TNF-α）的表達，募集MDSCs，抑制細胞毒性T細胞（cytotoxic T cell，CTL）功能[11]。

2.3 Hippo信號通路與PD-L1相關

從單個TIC的形成到發展為惡性腫瘤的整個過程中，Hippo信號通路的抑制有助于腫瘤從宿主免疫監測中逃逸，特別是在Yap相關的腫瘤發生中。參與調節免疫監測的重要分子程序死亡配體1（programmed death ligand，PD-L1），與PD-1的相互作用誘導并維持T細胞耐受，延長腫瘤細胞的存活（圖1d）。

在非小細胞肺癌的研究[12]提示Hippo-Yap信號與PD-L1密切相關，細胞核內Yap-TEAD復合物的形成促進腫瘤細胞PD-L1的表達，進而可導致免疫監控系統對惡性腫瘤細胞的失能。在腫瘤組織中Yap和PD-L1表達顯著相關，表達高水平PD-L1細胞系中，磷酸化Yap/Yap的比率低，抑制Yap可降低PDL1的mRNA和蛋白水平；Yap基因的強制過度表達提高PD-L1的mRNA和蛋白質水平。染色質免疫沉淀（CHIP）分析使用Yap特異性單克隆抗體導致PD-L1增強子區域的沉淀，包括兩個假定的TEAD結合位點。

在人乳腺癌和肺癌細胞系體外模型研究中均證實TAZ和PD-L1蛋白水平的相關性，表明Hippo通路效應因子YAP和TAZ直接上調PD-L1的表達，抑制抗腫瘤T細胞免疫反應[13]。CHIP和熒光素酶檢測發現TAZ/YAP/TEAD復合物增強PD-L1 啟動子活性，共培養實驗證明其在腫瘤細胞免疫逃逸中的具有重要意義。Lee等認為[14]Yap是人類肺腺癌細胞PD-L1表達的轉錄調控因子；表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）的耐藥與Yap、PD-L1表達具有相關性；Yap敲除的腫瘤細胞PD-L1表達水平降低；上游調節因子（PI3K、RAF）和Hippo通路中的信號分子（MST1/2, LATS1/2）也可調控PD-L1的表達。Hippo信號可能通過調控PDL1的表達參與免疫逃避。但這種調節機制尚未在小鼠細胞系模型中發現。

Feng等研究證實Hippo信號在人類肺腺癌中的表達受細胞外環境pH值的影響，進而導致TAZ介導的PD-L1上調。在腫瘤乳酸水平和PD-L1表達相關性研究模型中，G蛋白偶聯受體 81 （G-protein-coupled receptors, GPR81）通過細胞內cAMP的耗竭啟動乳酸誘導的PD-L1上調水平，抑制蛋白激酶A（protein kinase A, PKA），激活Yap/TAZ； Hippo信號通過PD-L1介導局部免疫抑制,重塑腫瘤微環境；Yap/TAZ抑制腫瘤細胞外圍的適應性T細胞對腫瘤細胞免疫應答反應；腫瘤細胞可能通過局部微環境中物理、生化刺激Hippo信號調控PD-L1表達以逃避免疫清除[15]。

3 Hippo信號通路中Yap磷酸化存在的爭議

Hippo信號通路發揮效應的核心歸因于Yap磷酸化，磷酸化的Yap決定Hippo信號是否激活或失效。其他激酶也可調節磷酸化Yap水平和活性。如胞漿中Yap 在S127上磷酸化后使之滯留在細胞質，或進一步被酪蛋白激酶1（casein kinase 1，CK1）磷酸化、并通過蛋白酶體使其降解；在S381上磷酸化會導致Yap的降解；在Y357上磷酸化可誘導細胞凋亡，但在Yes1上的磷酸化會誘導抗凋亡作用[16,17]。細胞所處環境以及磷酸化的位點不同而產生不同效應[18]，因此Hippo-Yap信號通路在某些情況下表現出雙重性。

圖1 Hippo通路與腫瘤免疫。a，dKO MST1/2誘導Yap依賴的MCP1過表達，促進腫瘤相關巨噬細胞聚集；b，單個腫瘤細胞調節Hippo通路并激活Yap，表達細胞因子并招募II型巨噬細胞，抑制T細胞免疫清除； c，活化的Yap提高了Cxcl5水平，促進MDSCs招募和T細胞抑制；d，Yap通過促進PD-L1的表達使腫瘤細胞逃避宿主免疫監視，抑制細胞免疫Fig. 1 Hippo pathway is involved in tumor immunology. A, dKO MST1/2 induced the Yap-dependent MCP1 overexpression and promoted the aggregation of tumor-related macrophages; b, a the tumor cell can modulate Hippo pathway to activate Yap, and thus express certain cytokines and recruit type II macrophages, which prohibit immune clearance of T cells; c, activated YAP raises Cxc15 level, so MDSCs are recruited and T cells are suppressed;d, Yap promotes the expression of PD-L1 to enable tumor cells to evade host immune surveillance and suppress cellular immunity

對于非Yap依賴的腫瘤研究發現，有研究證明Yap可抵消主導腸組織自我更新和再生的信號通路Wnt/β-catenin通路的促腸組織的再生的作用[2]；在淋巴瘤、骨髓瘤等惡性血液病中Yap通過與p53的同源基因p73相互作用，促進腫瘤細胞發生凋亡[19]。除了Yap，Hippo信號通路的上游成員LATS1/2也表現為兩方面的作用[20]：LATS1/2磷酸化Yap，促進其細胞質隔離以及限制細胞增殖；但LATS1/2失活會促發針對自身細胞的免疫反應，進而破壞LATS1/2沉默的相應細胞，維持個體的免疫穩態。

Moroishi等人提出Hippo通路的分子LATS1/2缺失引發抗腫瘤反應[20]：盡管LATS1/2作為Hippo通路中Yap的上游信號分子，通過磷酸化Yap防止核易位，但其敲除后引發的抗癌反應遠遠強于激活Yap引發的促生長效應。LATS1/2敲除的細胞在體外實驗中表現出更強的增殖能力，表明細胞生長的最初并不依賴于Yap過表達或Hippo通路功能障礙。LATS1/2敲除的腫瘤細胞通過分泌更多富含核酸的細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），進而激活Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）。下游涉及TLRs的內源性核酸通路被激活，進而激活免疫應答，這項研究證明LATS1/2敲除的細胞引導機體發生更強大的免疫反應消滅自身。

4 展望

綜上所述，越來越多Hippo通路相關的分子機制的發現拓寬了研究視野，復雜的微環境可能導致Hippo通路作用的多重性，Hippo通路的調節處于動態調節的過程，以調控細胞的增殖與凋亡的平衡，以及內環境的穩定；Hippo信號在不同的環境中發揮不同效應，其詳盡機制仍有待探討。近年來其相關抗癌治療的藥物，例如以Yap為治療靶點的抗腫瘤藥物的開發還處于初級階段，其應用前景正逐步在擴大；若聯合通過阻斷T細胞活化共抑制信息分子（co-inhibitory molecules）的癌癥監測點阻斷（immune checkpoint blockade）免疫治療，或可成為影響癌癥的策略和手段。全面揭示Hippo-Yap信號通路精確的分子調控機制，為臨床抗腫瘤治療研究尋求潛在靶點，為精準治療藥物的研發提供廣闊的思路。