丁香酚在斜帶髭鯛體內蓄積與消除規律及休藥期

劉海新，余 穎，羅方方，湯水粉，馬文學，陳 思，鄭一玲

（1.福建省水產研究所，福建 廈門 361013；2.福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013；3.福建省海洋生物資源開發利用協同創新中心，福建 廈門 361013）

丁香酚（eugenol）為苯丙素類化合物，可從丁香樹、柴桂等多種植物中提取[1]，有麻醉水生動物的生理作用[2]。丁香酚可有效降低魚的應激效應，提高運輸密度和存活率，因此在活魚運輸環節中使用率高。當前我國對麻醉劑用于食用水產品尚未開放，因此采用丁香酚麻醉食用活魚并不合法。目前丁香酚殘留可能導致食用安全風險已引起行業主管部門關注。近年來研究表明，長期食用高濃度丁香酚殘留食品會影響人體健康。美國國家毒理學規劃處研究認為丁香酚具可疑致癌性[4]；歐洲食品安全委員會進一步研究表明丁香酚對兔子有生長發育毒性，并制定每kg 人體每日允許攝入量為1.0 mg[5]。因此，研究水產品中丁香酚殘留與消除有重要意義。

丁香酚于在水產方面應用研究重點在其對水生動物的麻醉效果[6-16]，而對丁香酚在水生動物體內蓄積消除規律研究較少，僅見對虹鱒（Oncorhychus myskiss）[17]、羅非魚（Oreochromis niloticus）[18]、銀鱸（Bidyanus bidyanus）[19]、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）[20]的研究。筆者以斜帶髭鯛（Hapalogenys nitens）為實驗動物，模擬長途運輸麻醉過程，研究丁香酚在其血漿、肌肉、肝臟中蓄積和消除規律，并采用線性回歸統計分析估算休藥期，為丁香酚應用于水產動物運輸的食用安全評估提供基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 斜帶髭鯛體質量為（450±50）g，泉州市泉港肖厝養殖戶提供。實驗前在室內循環水族箱內暫養1 周。養殖用水為沙濾海水，曝氣48 h后使用，鹽度26，養殖過程不斷充氧，保持水中溶解氧大于6.0 mg/L，每天換水1 次，投喂不含藥物的凍干磷蝦。挑選體表完整、活力強、無病無傷個體進行實驗。

1.1.2 試劑及主要儀器 丁香酚標準品，Sigma 公司，純度≥99%；乙酸丁香酚酯標準品，德國Dr.Ehrenstorfer 公司，純度≥97%；分析純丁香酚，上海麥克林生化科技有限公司，純度≥99 %；正己烷，美國TEDIA 試劑公司，色譜純；無水硫酸鈉，國藥集團化學試劑有限公司，經650 ℃灼燒4 h 于干燥器中冷卻備用；C18 和PSA 吸附劑，德國CNW 科技公司。

主要儀器有Agilent 7010 型三重四極桿氣質聯用儀（美國安捷倫科技有限公司）、色譜柱Thermo TG-17MS 石英毛細管柱（30 mm × 0.25 mm × 0.25μm）、TGL-16G 離心機（上海安亭）、TDL-40B 離心機（上海安亭）、AB204-E 電子分析天平（瑞士梅特勒托利多）、IKA MS3 旋渦混合器（德國IKA）、均質器Retsch GM200（德國Restch）。

1.2 方法

1.2.1 不同質量濃度丁香酚麻醉效果 設置丁香酚質量濃度梯度為2.5、5.0、7.5、10、20、40 mg/L，每個梯度實驗魚10 尾，放入麻醉液中麻醉1 h 后轉入海水中復蘇，觀察魚體進入不同麻醉及復蘇分期的行為特征并計時。用同樣質量濃度梯度的丁香酚溶液，每個梯度實驗魚10 尾，分別麻醉魚6 h 和12 h 后轉入海水中復蘇1 h，記錄魚復蘇率。

1.2.2 藥浴麻醉和海水復蘇 用海水根據1.2.1 結果配制丁香酚溶液。取斜帶髭鯛70 尾，分別放入7個150 L 水族箱，每箱10 尾。水族箱中預先注入配制的丁香酚溶液。另取10 尾作為空白對照組不給藥。麻醉過程不斷充氧，于給藥后0.16、0.33、0.66、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0 h，隨機從水族箱中取6 尾，自尾靜脈采血，加入10 g/L 抗肝素鈉0.3 mL（抗凝），混勻后離心，取上清血漿；剖取肝臟，用研缽磨碎均質后裝入離心管中；剖取肌肉，用均質器均質后裝入廣口玻璃瓶。血漿及組織樣品于-18 ℃保存，待測。另取130 尾斜帶髭鯛按上述方法麻醉8 h 的魚，分別放入9 個裝有300 L海水的水族箱中，每箱≤15 尾，每日換水1 次。養殖用水為沙濾海水，曝氣48 h 后使用，鹽度26，養殖過程不斷充氧，保持水中溶解氧大于6.0 mg/L。于0.16、0.5、1.0、2.0、5.0、7.0、8.0、10、15、24、48、72、96、144、216、264、312、360、408、456 h 隨機從水族箱中分別取魚6 尾，同法采集血及肌肉與肝臟。為研究不同季節活魚麻醉運輸和海水復蘇過程中丁香酚在魚體內變化規律，分別于水溫15 ℃和25 ℃條件下進行上述實驗。

1.2.3 樣品前處理 采用QuCHERS 法進行。以正己烷提取魚體組織中丁香酚，無水硫酸鈉吸取多余水分，PSA 和C18 去除干擾物。方法如下：

血漿：將冷凍保存的血漿于室溫下自然解凍，混勻，吸取0.5 mL 加入200 ng/mL 內標（乙酸丁香酚酯）溶液500 μL、正己烷2.5 mL 和無水硫酸鈉2 g，旋渦震蕩2 min，以4 000 r/min 離心10 min，吸取上清液，用2.5 mL 正己烷重復提取1 次，合并上清液。取2.0 mL 提取液加入吸附劑PSA、C18 各100 mg 和無水硫酸鈉200 mg，渦旋混合2 min，靜置5 min，以12 000 r/min 離心10 min，取上清液，過孔徑0.22 μm 濾膜后待測。

肌肉和肝臟：將冷凍保存樣品于室溫下自然解凍，稱?。?.0±0.1）g，加入200 ng/mL 內標（乙酸丁香酚酯）溶液1.00 mL、正己烷5 mL 和無水硫酸鈉2 g，旋渦震蕩2 min，以4 000 r/min 離心10 min，吸取上清液，再用5 mL 正己烷重復提取1 次，合并上清液。取提取液2.0 mL，加入吸附劑PSA、C18各100 mg 和200 mg 無水硫酸鈉，渦旋混合2 min，靜置5 min，以12 000 r/min 離心10 min，取上清液，過孔徑0.22 μm 濾膜后待測。根據預實驗情況，對濃度較高的血漿和組織樣品稀釋到線性范圍內檢測。

1.2.4 儀器檢測 色譜條件：進樣口溫度250 ℃；不分流進樣；進樣量1 μL；初始溫度為80 ℃,保持2 min，以10 ℃/min 升溫至190 ℃，再以20 ℃/min升溫至250 ℃保持5 min；氦氣為載氣（純度 ＞99.999%），流量為1.2 mL/min。

質譜參數：電子轟擊能量為70 eV；離子源和四級桿溫度分別為250、150 ℃；傳輸線溫度250 ℃；氮氣為碰撞氣，流量1.5 mL/min；氦氣為淬滅氣，流量為2.25 mL/min；溶劑延遲8 min。

采用多重反應監測（Multiple reaction monitoring，MRM）模式進行，丁香酚以核質比m/z149 作為定量離子、m/z104 作為輔助定性離子；對內標乙酸丁香酚酯以m/z149 作為定量離子、以m/z131 作為輔助定性離子。離子監測參數見表1。

表1 丁香酚和丁香酚乙酸脂離子監測參數Table 1 Monitoring parameters for eugenol and eugenyl acetate detection in mass spectrometry

1.2.5 標準曲線繪制 取空白對照組斜帶髭鯛的血漿和肌肉、肝臟組織，分別添加不同量的丁香酚標準工作液，使提取液質量濃度分別為0.1、0.4、2.0、10、20、50、100、500 ng/mL。按上述樣品前處理方法處理后進行GC-MS/MS 分析，用內標法對丁香酚含量進行定量。

1.2.6 檢測結果的可靠性和定量限 取空白血漿，加入不同濃度的丁香酚，使血漿中丁香酚質量濃度分別為1.0、5.0、50、500 μg/L，每個濃度取6 個平行樣品，檢測回收率為78.4%～ 96.5%，相對標準偏差為6.59%～ 9.12%。取空白肌肉，加入不同濃度的丁香酚，使肌肉中丁香酚質量濃度分別為1.0、5.0、50、500 μg/kg，每個濃度取6 個平行樣品，檢測回收率為79.1%～ 88.8%，相對標準偏差為5.12%～ 11.2%。取空白肝臟，加入不同濃度丁香酚，使肝臟中丁香酚質量濃度分別為2.0、5.0、50、500 μg/kg，每個濃度取6 個平行樣品，檢測回收率為77.2%～88.3%，相對標準偏差為4.11～ 12.8 %。因此，所用檢測方法符合藥物分析要求。根據信噪比大于10及回收率70%～ 120%的要求，確定肌肉和血漿定量限為1 μg/kg，肝臟定量限為2 μg/kg。

1.2.7 休藥期估算 日本對丁香酚在魚類中最高殘留限量（MRL）為50 μg/kg[22]，依據該限量水平參照歐洲藥品管理局（European Medicines Agency，EMA）方法[21]估算休藥期。即lnCt=-kt+lnC0，Ct為不同時間點組織中藥物濃度，C0指數前因子（時間t=0 時，組織中藥物濃度）。EMA 推薦，以動物組織中藥殘濃度（正態分布單側95%置信限95%容許上限）低于最高殘留限量（MRL）時間為休藥期（d）。如算得結果不是整數，應以“d”為單位向上取整。

1.3 數據處理

采用DAS2.0 藥代動力學軟件對藥-時數據進行模型擬合并計算主要代謝動力學參數，用SPSS22.0 統計軟件分析數據的相關性、顯著性以及方差。

2 結果與分析

2.1 丁香酚麻醉斜帶髭鯛濃度確定

丁香酚對不同魚類的麻醉表現各有差異，參考文獻 [11-13]，將麻醉和復蘇分別分為A1 -A4、R1-R4 各4 個階段，各階段行為特征見表2。

表2 斜帶髭鯛麻醉與復蘇分期及行為特征Table 2 Behavior of Hapalogenys nitens in different anaesthetic and recovery stages

由表3 和表4 可知，在2.5 mg/L 的丁香酚中，斜帶髭鯛即有麻醉反應；5.0～ 7.5 mg/L 的丁香酚就能使斜帶髭鯛產生魚體失去平衡、平躺到容器底部的麻醉效果；質量濃度為10 mg/L 丁香酚溶液可使斜帶髭鯛進入深度麻醉狀態，麻醉12 h 后，復蘇率為90%。斜帶髭鯛經20 mg/L 丁香酚溶液麻醉6 h，復蘇率90%，麻醉12 h 復蘇率70%。經40 mg/L 丁香酚溶液麻醉6 h，斜帶髭鯛全部死亡。說明超過20 mg/L 丁香酚溶液對斜帶髭鯛有一定毒性作用。

據了解，長途運輸過程中用丁香酚麻醉魚時，丁香酚用量難以準確控制，主要通過觀察藥物對魚的麻醉效果而定。只要魚活動能力明顯降低、沉到水箱底部，即可達到長途運輸降低死亡率的目的，并不將魚麻醉到完全失去活動能力狀態，即魚被麻醉程度相當于“反應遲鈍，鰓蓋張合頻率緩慢，魚體失去平衡”的A2 麻醉階段；部分長途運輸中的魚也會進入“失去反應能力，鰓蓋張合沒規律，平躺于容器底部”的A3 麻醉階段。表2～ 4 可見，丁香酚質量濃度定為7.5 mg/L 時，斜帶髭鯛進入A3麻醉階段，但不進入深度麻醉的A4 階段，可確保經長時間麻醉后的復蘇率仍較高。因此，確定麻醉斜帶髭鯛的丁香酚質量濃度為7.5 mg/L。

2.2 丁香酚在魚體內濃度變化和代謝動力學參數

2.2.1 藥浴麻醉 在水溫（15±2）℃條件下，7.5 mg/L 丁香酚溶液藥浴麻醉的藥物在血漿、肌肉、肝臟中藥-時曲線見圖1。圖1 可見，藥浴過程中，丁香酚在不同組織中蓄積趨勢一致。各組織藥物濃度組藥浴2 h 后達到峰值，在藥浴8 h 內基本保持穩定。（15±2）℃和（25±2）℃水溫環境條件下，麻醉過程丁香酚在魚體內蓄積變化見圖2～ 4。結果表明，溫度會顯著提高丁香酚在魚體內蓄積濃度，高溫條件下絕大部分時間點血漿和組織中丁香酚濃度值均高于低溫條件下對應時間點。

表3 不同質量濃度丁香酚對斜帶髭鯛麻醉效果Table 3 Anaesthetic effect of eugenol at different concentration on Hapalogenys nitens

表4 不同質量濃度丁香酚長時間麻醉對斜帶髭鯛的影響Table 4 Effect of eugenol concentration on recovery of Hapalogenys nitens

圖1 15 ℃藥浴麻醉中血漿、肌肉、肝臟丁香酚藥-時曲線Fig.1 Eugenol concentration in tissue during the period of anaesthetization at 15 ℃

圖2 不同溫度下麻醉過程血漿中丁香酚藥-時曲線Fig.2 Eugenol concentration in plasma at different temperature during the period of anaesthetization

圖3 不同溫度下麻醉過程肌肉中丁香酚藥-時曲線Fig.3 Eugenol concentration in muscle at different temperature during the period of anaesthetization

圖4 不同溫度下麻醉過程肝臟中丁香酚藥-時曲線Fig.4 Eugenol concentration in liver at different temperature during the period of anaesthetization

在丁香酚藥浴麻醉過程中，斜帶髭鯛各組織中丁香酚達到最高濃度時間和濃度值見表5。

表5 斜帶髭鯛藥浴麻醉時丁香酚的達峰時間和達峰濃度Table 5 Eugenol peak time and peak concentration of Hapalogenys nitens during the period of anaesthetization

表5 表明，采用7.5 mg/L 丁香酚麻醉斜帶髭鯛，藥物達峰時間tmax由小到大依次為血漿、肌肉、肝臟。15 ℃和25 ℃水溫條件下，肝臟達峰濃度Cmax分別為160.07 mg/kg 和185.20 mg/kg，顯著高于肌肉和血漿。水溫從15 ℃升到25 ℃，斜帶髭鯛血漿丁香酚達峰時間tmax從2.00 h 降至1.50 h，肌肉中tmax從3.00 h 降至2.00 h，蓄積速度有所加快，而肝臟中tmax無明顯影響。溫度對魚體中丁香酚蓄積影響還表現在各組織達峰濃度上，血漿、肌肉和肝臟的Cmax增加幅度分別為29.8%、24.5%和15.7%。因此，升溫可提高丁香酚在魚體內蓄積速度及濃度水平。

2.2.2 復蘇 圖5 可見，斜帶髭鯛經丁香酚溶液麻醉8 h 后在海水中復蘇時，丁香酚在魚體內快速降解，48 h 時血漿和肌肉中丁香酚濃度低于50 μg/kg，48～ 456 h（19 d）丁香酚在4～30 μg/kg 范圍無規律變化。肝臟中丁香酚48 h 后在80～ 400 μg/kg 范圍無規律變化。

根據赤池信息量準則（Akaike information criterion，AIC）最小原則判斷（權重系數取1/c2），斜帶髭鯛復蘇時丁香酚在魚體內代謝過程符合二室模型，主要藥物代謝動力學參數見表6。水溫從15 ℃升高到25 ℃，丁香酚在斜帶髭鯛血漿中平均駐留時間MRT（0-t）從6.464 h 降至6.076 h，在肌肉中從4.001 h 降至3.756 h，在肝臟中從6.670 h 降至5.791 h，降幅分別為6.00%、6.12%、13.17%，代謝速度隨溫度升高有所加快。

圖5 斜帶髭鯛魚體復蘇丁香酚藥-時曲線Fig.5 Eugenol concentration in tissue during the period of recovery

表6 不同溫度下斜帶髭鯛體內丁香酚降解過程藥物代謝動力學參數Table 6 Pharmacokinetic parameters of Hapalogenys nitens during the period of recovery at different temperature

斜帶髭鯛血漿、肌肉和肝臟丁香酚在降解過程中的濃度均出現反復現象（圖6～ 8）。血漿和肝臟丁香酚濃度均在復蘇5 h 時升高，肌肉丁香酚濃度在3 h 時升高。各組織丁香酚濃度升幅差異大。肝臟從3.02×103μg/kg 回升到1.37×104μg/kg，升幅為353%；血漿從167 μg/kg 回升到257 μg/kg，升幅為 53.9%；肌肉從 1.77×103μg/kg 回升到2.78×103μg/kg，升幅為57.1%。肝臟丁香酚升幅遠大于肌肉和血漿。

溫度升高對魚體血漿、肌肉、肝臟中丁香酚含量影響見圖9～ 11。由圖9～ 11 可見，不同溫度下復蘇48 h 后斜帶髭鯛血漿、肌肉和肝臟中丁香酚殘留濃度差異無統計學意義（P＞ 0.05），說明溫度變化對各組織中丁香酚長時間殘留濃度影響不大。

圖6 復蘇20 h 血漿中丁香酚藥-時曲線Fig.6 Eugenol concentration in plasma during the period of recovery in 20 hours

圖7 復蘇20 h 肌肉中丁香酚藥-時曲線Fig.7 Eugenol concentration in muscle during the period of recovery in 20 hours

圖8 復蘇20 h 肝臟中丁香酚藥-時曲線Fig.8 Eugenol concentration in liver during the period of recovery in 20 hours

圖9 不同溫度下復蘇過程血漿中丁香酚藥-時曲線Fig.9 Eugenol concentration in plasma during the period of recovery at different temperature

圖10 不同溫度下復蘇過程肌肉中丁香酚藥-時曲線Fig.10 Eugenol concentration in muscle during the period of recovery at different temperature

圖11 不同溫度下復蘇過程肝臟中丁香酚藥-時曲線Fig.11 Eugenol concentration in liver during the period of recovery at different temperature

2.3 丁香酚在魚肌肉中的休藥期

將表7 中肌肉丁香酚濃度值取自然對數，最小二乘法線性回歸方程為y=-0.092 7x+6.907 0，相關系數R=0.915 8。以線性回歸統計分析估算休藥期，所采用的數據需滿足方差齊性檢驗、失擬檢驗、殘差正態分布檢驗要求。如數據未通過這些檢驗，說明數據中存在離群值或所采用的時間點組織中藥物不在代謝末端消除期，需剔除離群值或重新選擇其他時間點的數據進行計算。

以柯克倫（Cochran）檢驗不同時間點殘留濃度對數值的方差齊性[23]，計算得統計量C=0.407，小于顯著水平α=0.05 統計量臨界值C=0.590，因此不同組數據的方差齊性符合要求；為確保擬合回歸線性相關性滿足統計要求需進行失擬檢驗，過程見表8。對給定顯著水平α=0.05，計算所得統計量F=0.421 1 ＜F0.95（2,22）=3.44，因此認為，殘留濃度對數值是時間的線性函數；在線性回歸模型中，殘差應服從正態分布。將殘差除以Sy·x（剩余標準差）進行標準化，數值范圍在-2.022～ 1.439 之間，均未超過4 倍剩余標準差的判定限。應用SPSS22.0軟件“探索分析”功能，對標準化殘差進行正態分布檢驗（Shapiro-Wilk），同時繪制正態分布檢驗Q-Q圖，觀察是否有離群值。Shapiro-Wilk 檢驗的顯著性P=0.315 ＞ 0.05，接受殘差正態分布的假設。標準化殘差分布均在預期直線周圍，未發現較大偏離值如圖12。通過上述3 項檢驗，說明用于休藥期估算所采用的24 個數據符合線性回歸分析要求。

表8 肌肉殘留方差分析Table 8 ANOVA for muscle

圖12 殘差正態分布檢驗Q-Q 圖Fig.12 Resdiuals normality test Q-Q plot

以正態分布單側95%置信限95%容許上限計算藥物在組織中不同時間點殘留量水平，繪制曲線如圖13。該曲線低于最高殘留限量（MRL=50 μg/kg）對應時間50 h，即2.08 d。因此，休藥期確定為3 d。

圖13 肌肉休藥期計算結果（95%置信度95%容許上限）Fig.13 Withdrawal period calculation for muscle(95%tolerance limit with 95% confidence)

3 討論

3.1 丁香酚殘留檢測方法

目前，動物體內丁香酚殘留檢測方法主要包括液相色譜法[24-25]、氣相色譜法[26]和質譜聯用法[27-28]，其前處理方法主要為均質震蕩提取、液-液分配萃取、固相萃取等。近年來有學者采用QuEChERS 法前處理[29]，以簡化前處理過程，提高檢測效率。因此，本研究運用QuEChERS 技術檢測前處理樣品，采用GC-MS/MS 進行定量檢測。

3.2 丁香酚在斜帶髭鯛體內累積及代謝動力學特征

本研究表明，麻醉過程中各組織丁香酚達峰時間血液最小，肌肉和肝臟次之，說明藥物先進入血液循環，隨血液分布到肌肉和肝臟；肝臟中丁香酚濃度峰值遠高于其他組織，說明丁香酚在肝臟蓄積，丁香酚可能主要在肝臟中代謝；升溫加快了丁香酚在魚體內的蓄積并提高其峰值濃度，Kildea等[19]用 15 mg/L 丁香酚麻醉銀鱸（Bidyanus bidyanus）時發現，高溫也導致銀鱸魚體內丁香酚蓄積濃度有所提高。梁政遠等[13]和陳德芳等[14]研究認為，溫度升高會加快麻醉液經鰓絲或體表滲入魚的速率，縮短麻醉作用時間，與本研究結果一致。

斜帶髭鯛經丁香酚麻醉8 h 后放入海水中復蘇，體內丁香酚濃度快速下降。血漿、肌肉和肝臟中丁香酚濃度在10 h 內下降超過50%，這與丁香酚在虹鱒魚（Oncorhynchus mykiss）[17]、羅非魚（Oreochromis niloticus）[18]、銀鱸（Bidyanus bidyanus）[19]、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)[20]中消除規律類似。斜帶髭鯛在復蘇過程中丁香酚在血漿、肌肉和肝臟中表現出滯留的現象，在其他動物體也有類似特點，如丁香酚在蛙（Xenopus laevis）血漿中半衰期為4 h[30]，在大鼠（Rattus norvegicus）血漿中半衰期為18.3 h[31]。復蘇過程斜帶髭鯛血漿、肌肉和肝臟中丁香酚降解均出現濃度反復現象，可能是丁香酚在魚體內存在肝腸循環、胃腸循環現象所致。類似情況也出現在凡納濱對蝦[20]和大鼠[32]中，丁香酚等苯酚共軛化合物在動物體內代謝過程中，往往出現再循環現象。

研究表明，經丁香酚麻醉的鯉魚（Cyprinus carpio）[13]和鯽魚（Carassius auratus)[14]復蘇時間隨溫度的升高而縮短，本研究中，溫度升高亦加快丁香酚在魚體內的代謝速度?？赡苁且驗殡S著水溫升高，魚體的心跳和呼吸頻率加快，新陳代謝較低溫時期增強，加快了丁香酚在魚體內的代謝，符合魚類的代謝規律[14]。

Kildea 等[19]研究表明，首次使用丁香酚麻醉銀鱸，48 h 后在魚肉中未檢出丁香酚；二次充分麻醉，一周后仍可在銀鱸肌肉中檢出丁香酚。方曉磊等[22]研究認為，活魚對初次吸收的丁香酚消除能力強，魚肉中丁香酚殘留消除快，但也削弱了魚體對丁香酚消除能力，二次給藥后的魚肉中丁香酚殘留消除時間長。本研究長時間藥浴麻醉類似于連續多次給藥，導致丁香酚在魚體內保持低濃度長時間殘留。這可能是麻醉過程中丁香酚隨血液分布到組織中與蛋白結合的結果。由于麻醉時間長，丁香酚與蛋白充分結合，魚體內結合型丁香酚遠高于游離型，起藥庫的作用。將魚放入海水復蘇后，體內游離丁香酚濃度逐漸降低，與蛋白結合的丁香酚緩慢釋放，同時還存在肝腸循環、胃腸循環等現象，導致低濃度游離丁香酚在魚體內長時間存在。

溫度對低濃度藥物在動物體內長時間殘留影響不顯著。Kildea 等[19]研究不同溫度下復蘇麻醉的銀鱸（Bidyanus bidyanus），結果發現魚體內低濃度丁香酚殘留量差異也不顯著。筆者認為可能是由于魚體內結合型丁香酚和游離丁香酚之間的化學平衡，在15～ 25 ℃范圍內受溫度影響小，仍需進一步研究證實。

3.3 丁香酚休藥期估算

孫宇航等[18]根據丁香酚在羅非魚血漿消除規律方程估算8 d 后血漿中丁香酚低于檢測限，確定休藥期為8 d；彭勤等[20]根據經丁香酚麻醉后的凡納濱蝦48 h 后體內丁香酚濃度降低至0.8～1 μg/kg，得出休藥期不少于48 h；Kildea 等[19]檢測麻醉一周后的銀鱸肌肉濃度平均值為0.32 mg/kg，依據每日允許攝入量（ADI）推算該濃度不會對人體健康產生影響。這些關于休藥期的估算是以用藥后某個時間點丁香酚殘留量低于安全限為依據，未充分考慮到該時間點藥物在動物體內代謝所處階段、生物個體間代謝能力差異和統計學上合理偏差范圍。以這種方式估算的休藥期可能與實際情況存在一定偏離。本研究參照EMA 估算動物休藥期指南，運用統計學方法將可能導致結果偏離的不確定因素考慮在內，繪制95%置信度95%容許上限曲線，以日本對魚體中最大殘留限量50 μg/kg 限量標準為界，得出3 d 休藥期的結果。由于不同種類水產動物生理特點不同，對丁香酚代謝能力較大差異，丁香酚的使用濃度差別大。因此確定水產品運輸合理的丁香酚休藥期，還應對不同種類水產品開展休藥期研究，按水產動物類別綜合考慮制定休藥期。

4 結論

1）在15℃以上水溫條件下，經丁香酚麻醉8 h的斜帶髭鯛，放到海水中3 d 復蘇，肌肉中丁香酚濃度在95%置信度95%容許上限低于50 μg/kg，符合日本對魚體最大殘留限量要求。建議經丁香酚麻醉運輸的斜帶髭鯛休藥期為3 d。

2）經丁香酚長時間麻醉的斜帶髭鯛，該藥物在魚體內保持低濃度長時間存在。