過熱蒸汽對熟制小龍蝦優勢腐敗菌的殺菌動力學及其機理

張澤偉，段偉文，陳 銘，鄧楚津，劉書成,2,3,4，吉宏武,2,3,4

（1.廣東海洋大學食品科技學院/ 2.廣東省水產品加工與安全重點實驗室/ 3.廣東省海洋食品工程技術研究中心/4.水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東 湛江 524088）

小龍蝦，學名克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），自1929 年引入我國后，被大范圍推廣養殖。2016 年，我國已是全世界最大小龍蝦生產國，其加工產業快速發展的同時也遇到了諸多問題[1-2]。與其他冷藏水產品相比，小龍蝦含有較多自由氨基酸，致使其更容易遭受微生物作用而腐敗變質，貨架期較短，成為限制小龍蝦產業進一步發展的主要障礙[3]。如何有效地殺滅小龍蝦產品中腐敗菌，前人已有相關殺菌方式的研究報道。其中巴氏滅菌能較大程度保持小龍蝦產品滅菌后品質，但殺菌效果不理想。高溫高壓滅菌能較好殺滅微生物，但對產品風味與口感等影響較大[4]。因此選擇合適殺菌方式是小龍蝦產業急需解決的問題。

過熱蒸汽是指在恒定的壓力下對飽和蒸汽繼續加熱，使其溫度升高到相應沸點以上的高溫水蒸氣[5]。與傳統熱處理方式相比，過熱蒸汽的傳熱方式除對流傳熱和輻射傳熱，還有冷凝傳熱；在殺菌過程中蒸汽在物料表面冷凝，釋放大量的熱，使物料快速升溫同時大幅度殺滅微生物，縮短殺菌時間，保障產品品質。且在殺菌過程中過熱蒸汽提供低氧環境，避免氧化反應，降低有害物生成。近些年過熱蒸汽殺菌作為一種綠色熱加工技術而備受關注[6]。目前，研究已發現過熱蒸汽對大腸桿菌（Escherichia coli）[7]、嗜熱芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus）[8]、沙門氏菌（Salmonella）[9]等微生物具有良好的殺菌效果。然而，過熱蒸汽殺菌技術對小龍蝦產品優勢腐敗菌殺滅效果的研究尚未有文獻報道。

微生物殺菌動力學研究是殺菌技術運用的關鍵理論之一，它可以定量評價殺菌的效果、提供合適的殺菌設計標準，對殺菌技術的實際應用具有理論指導意義[10]。目前，已研究多種殺菌技術對不同微生物的殺菌動力學，例如超聲輔助超臨界CO2殺滅大腸桿菌（E.coli）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的動力學[11]，微波和巴氏滅菌殺滅大腸桿菌O157：H7（Escherichia coliO157：H7）和李斯特菌（Listeria monocytogenes）的動力學[12]和過熱蒸汽殺滅沙門氏菌和蠟樣芽孢桿菌的殺菌動力學[13]。然而，過熱蒸汽對小龍蝦優勢腐敗菌的殺菌動力學還未見有研究報道。

本研究以從腐敗小龍蝦產品中分離的優勢腐敗菌為研究對象，研究不同條件下過熱蒸汽溫度、流量和處理時間對小龍蝦產品優勢腐敗菌的殺菌效果及動力學，并初步探究其殺菌機理，以期獲得過熱蒸汽殺滅小龍蝦產品優勢腐敗菌的最佳條件，為指導過熱蒸汽在小龍蝦產品加工中的實際應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活小龍蝦（Procambarus clarkii），30～ 36 尾/kg，購于廣東省湛江市霞山區東風海鮮市場；營養肉湯(NB)、PCA 平板計數瓊脂、革蘭氏染色試劑盒，北京陸橋技術股份有限公司；Taq DNA 聚合酶、PCR引物，生工生物工程(上海)股份有限公司；基因組DNA 提取試劑盒，天根生化科技有限公司；體積分數25%戊二醛、無水乙醇、叔丁醇，均為分析純，廣東光華科技股份有限公司。

1.2 主要實驗儀器和設備

JSM-7610F 掃描電子顯微鏡，日本電子株式會社；SW-CJ-FD 潔凈雙人工作臺，蘇州凈化設備有限公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；Hema 9600 PCR 基因擴增儀，珠海黑馬醫療儀器有限公司；SLI-700 埃朗生化培養箱，東京理化器株式會社；HZQ-X100 全溫振蕩培養箱，蘇州培英實驗設備有限公司；FDU-1100 真空冷凍干燥設備，東京理化器械株式會社；Aglient Cary 60 紫外-可見光光度計，美國安捷倫科技公司；DDSJ-308A 電導率儀，上海儀電科學儀器股份有限公司；過熱蒸汽處理系統，自制[14]。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備 新鮮小龍蝦→超聲清洗→瀝干→油炸（170 ℃油炸3 min）→煮制（含5 g/100 mL食鹽的沸水中煮10 min）→冷卻→真空包裝→25 ℃下貯藏。

1.3.2 貯藏期間菌落總數與揮發性鹽基氮含量測定 每天測定熟制小龍蝦的菌落總數與揮發性鹽基氮含量。菌落總數測定方法參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》；揮發性鹽基氮采用自動凱氏定氮儀法測定，參照GB 5009.228-2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》。

1.3.3 腐敗菌的分離純化與鑒定 選取貯藏終點的小龍蝦樣品，在無菌超凈臺中將小龍蝦去頭、去殼，稱取25 g 蝦肉，用無菌剪刀剪碎后放入盛有225 mL 無菌生理鹽水的錐形瓶中，均質。按10 倍系列稀釋，稀釋至10-5。取100 μL 菌懸液均勻涂抹在營養瓊脂上，在37 ℃下，恒溫培養48 h 左右。挑選一個合適的平板（菌落數約30～100 CFU）計數，并挑起平板上全部可見菌落，進行編號，連續進行3 次劃線分離。用體積分數為20%甘油-80 ℃保存，以備后用。根據革蘭氏染色、細菌形態和菌落特征將獲得的菌株分組。將所有純菌株進行16S rDNA 的PCR 擴增，其產物送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序[15]。將測序結果在NCBI 網站上進行BLAST 系列分析，選取相似性99%以上菌株的基因序列，利用MEGA5.1 軟件進行鄰近法（Neighbor-Joining）構建系統發育樹。

1.3.4 菌懸液的配制 用接種環挑取一環小龍蝦的優勢腐敗菌接入無菌的營養肉湯（NB）中，180 r/min、37 ℃振蕩培養24 h，連續重復3 次[16]。將培養好的細菌菌懸液離心（5 000 r/min,15 min，4℃）。棄去上清液，將沉淀物重新懸浮在生理鹽水中至所需濃度，濃度范圍為108～ 109CFU/mL[17]。

1.3.5 過熱蒸汽殺菌實驗過程 首先設置好過熱蒸汽儀器的溫度、流量等參數（溫度參數為170、200、230 ℃，流量參數為19、24、29 m3/h），待整個系統溫度和流量穩定后，關閉閥門，快速將3根裝有4 mL 菌懸液的18mL 玻璃試管放在物料放置架上，關閉箱門。重新打開蒸汽閥門，同時記錄殺菌時間（殺菌時間為40、70、100、150、200、250、300 s）。殺菌完成后，將試管立即放入冰水中冷卻，直至微生物計數檢測[18]。

1.3.6 微生物計數 參照方法1.3.2 中菌落總數測定的方法檢測腐敗菌在過熱蒸汽處理前、后的數量。過熱蒸汽的殺菌效果采用微生物殘活率表示，見公式（1）。

過熱蒸汽處理前的菌懸液的菌落總數記為N0（CFU/mL）；過熱蒸汽處理后菌懸液的菌落總數記為N（CFU/mL）。

1.3.7 殺菌機理的菌懸液制備 按照1.3.4 的方法配制菌懸液，再按照1.3.5 的方法對菌懸液進行殺菌，具體的過熱蒸汽殺菌條件：過熱蒸汽溫度230 ℃、流量29 m3/h，處理時間分別為：0、40、70、100、150、200、250 s。

1.3.8 菌懸液電導率測量 對按照1.3.7 的方法所制備的菌懸液，使用電導率儀測定其電導率值。

1.3.9 菌懸液紫外吸收測量 對按照1.3.7 的方法所制備的菌懸液進行離心（5000 r/min,15 min，4 ℃），取上清液，在波長260 nm 處測定其吸光值。

1.3.10 細菌微觀形態的觀察 借助掃描電子顯微鏡對小龍蝦產品的優勢腐敗菌菌株細胞形態進行觀察。對按照1.3.7 的方法所制備的菌懸液進行離心（5 000 r/min,15 min，4 ℃，棄去上清液，下同），再加入0.1 mol/L pH＝7.0 的PBS 緩沖液，離心。加入適量的體積分數2.5%的戊二醛溶液固定過夜后離心。加入PBS 緩沖液，離心，重復3 次。分別加入30%、50%、70%、80%、90%、100%的乙醇逐級洗脫，每級洗脫10 min，離心，其中100%的乙醇洗脫2 次，其余洗脫1 次。再加入無水乙醇與叔丁醇（體積比＝1∶1）洗脫15 min，離心。最后叔丁醇洗脫15 min，離心。得到的菌泥再經真空冷凍干燥后，固定在金屬箔片上，噴金80 s，電鏡觀察。

1.4 殺菌動力學數學模型--Weibull 模型

式中，b為尺度參數，n為形狀參數，t為過熱蒸汽處理時間(s)。當n=1，曲線為一條直線，此時Weiibull 模型為一級動力學方程；當n＞ 1，曲線呈凸形；當n＜ 1，曲線呈凹形。

1.5 數據分析

每個實驗重復3 次，數據用“平均值±標準差”表示，使用Origin 8.5 軟件對實驗數據進行擬合分析并繪圖。

2 結果與分析

2.1 熟制小龍蝦貯藏期間菌落總數和揮發性鹽基氮變化

菌落總數直接反映熟制小龍蝦產品被細菌污染的程度和是否符合衛生要求，所以菌落總數在一定程度上表示小龍蝦產品是否具有可食性。揮發性鹽基氮含量表示小龍蝦產品由于受到微生物和酶的作用，本身蛋白質被分解產生氨和胺類等堿性含氮物質的程度[19]。圖1 是熟制小龍蝦在常溫下（25 ℃）貯藏過程中菌落總數和揮發性鹽基氮含量的變化，由圖1 可知，貯藏期間小龍蝦菌落總數一直持續增長，揮發性鹽基氮含量先緩慢增加后急劇上升。孫亞軍等[20]研究南美白對蝦蝦仁貯藏期間揮發性鹽基氮的變化規律，發現揮發性鹽基氮含量先緩慢增加后快速增加。熟制小龍蝦貯藏期間揮發性鹽基氮含量的增長規律與其類似。這是由于貯藏前期，產品微生物的數量較少，蛋白質被分解的程度較低，堿性含氮物質的含量較少。隨著貯藏時間延長，微生物數量增加，分解作用變強，從而使揮發性鹽基氮含量增加[21]。根據GB 10136-2015《食品安全國家標準 動物性水產制品》，判定熟制小龍蝦達到腐敗終點的菌落總數限量為 5×104CFU/g，揮發性鹽基氮限定值為30 mg/100 g。貯藏2 d，小龍蝦的菌落總數為4.47×105CFU/g，已超過限定值，此時揮發性鹽基氮含量為19.45 mg/100 g還未超標，揮發性鹽基氮指標滯后于菌落總數指標。綜合來看，貯藏2 d 的熟制小龍蝦已腐敗變質，到達貨架期的終點。

圖1 熟制小龍蝦菌落總數和揮發性鹽基氮含量隨貯藏時間的變化Fig.1 Change in total bacterial count and TVB-N value of cooked crayfish during storage

2.2 小龍蝦優勢腐敗菌的分離與鑒定

根據1.3.3，從稀釋度為10-3的平板上共挑取56 個菌落，然后分別劃線分離純化。根據圖2 可知，小龍蝦優勢腐敗菌構建的系統發育樹可判定A1 號菌為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）；B2 號菌為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）；C12號菌為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）；D4 號菌為賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus macroides）。它們均為革蘭氏陽性菌，并分別占挑取分離總菌落的19.64%、14.29%、42.86%和23.21%。

圖2 4 種優勢腐敗菌系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of four dominant spoilage bacteria

從小龍蝦產品中分離出的蠟樣芽孢桿菌和賴氨酸芽孢桿菌與相關文獻報道一致[22]。而解淀粉芽孢桿菌和短小芽孢桿菌是首次在腐敗小龍蝦產品中被發現。在真空包裝中，革蘭氏陽性菌的數量遠遠大于革蘭氏陰性菌[23]。蠟樣芽孢桿菌、解淀粉枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌均被認為是熟制食品的優勢腐敗菌，均在小麥面包[24]、魚糜[25]和烤雞[26]等中被發現。因煮制的殺菌溫度較低，同時解淀粉枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌具有良好耐熱性，所以他們能夠在煮制過程中存活并在貯藏期間生長繁殖。因此解淀粉枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌能夠在經煮制后的小龍蝦產品中大量存在并成為小龍蝦的優勢腐敗菌。

2.3 過熱蒸汽溫度和殺菌時間對小龍蝦優勢腐敗菌的殺菌動力學

研究過熱蒸汽流量為24 m3/h、不同過熱蒸汽溫度和殺菌時間對4 種優勢腐敗菌的滅活效果，其結果如圖3 所示。在整個殺菌過程，隨著殺菌時間延長，微生物殘活率持續下降，直到完全殺滅。但整個過程，微生物殘活率下降的速率是不同的。在殺菌初始階段，4 種優勢腐敗菌的殘活率均迅速下降，并呈現類似的趨勢。然后隨著過熱蒸汽處理時間的延長，4 種優勢腐敗菌的殘活率變化緩慢，趨于平緩。此外，過熱蒸汽對4 種小龍蝦優勢腐敗菌的殺菌動力學所擬合的生存曲線均為“拖尾”曲線。這是由于在過熱蒸汽處理初期，過熱蒸汽遇見冷試管時，蒸汽在試管表面冷凝，釋放出大量的熱量并傳遞給菌懸液，使其溫度快速升高，從而快速的殺死菌懸液中存活的細菌。隨著過熱蒸汽的處理，菌懸液中存在的熱敏性細菌個體被殺滅，留下耐熱性較強的細菌個體，導致殘活率下降速率變慢[27]。上述趨勢與過熱蒸汽殺滅嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子（Geobacillus stearothermophilusspores）的過程類似[28]。這種趨勢不僅與殺菌工藝有關，還與細菌細胞壁有關。4 種小龍蝦優勢腐敗菌均為革蘭氏陽性菌。革蘭氏陽性菌擁有多層肽聚糖和磷壁酸組成的堅固和厚實的細胞壁，磷壁酸有助于加強細胞壁的機械強度，從而提高細菌熱耐性[29]。

殺菌效果也受過熱蒸汽溫度的影響。過熱蒸汽對4 種小龍蝦優勢腐敗菌的滅活效果與過熱蒸汽溫度呈正相關。在相同殺菌時間，過熱蒸汽溫度為230 ℃的殺菌效果要優于170 ℃。較高過熱蒸汽溫度使蒸汽在冷凝時釋放大量的熱和較強的氣體輻射，因此使菌懸液的溫度上升得更快，具有更高的微生物殺菌效率[30]。同時，不同腐敗菌對不同過熱蒸汽溫度有不同的反應。蒸汽溫度170 ℃，殺菌時間為250 s 時，解淀粉芽孢桿菌的殘活率為-6.88，而在相同條件下，其他菌株對應的殘活率均＜-8。在相同溫度條件下，其殘活率不同，可能與菌株本身的耐熱性有關。在4 種小龍蝦優勢腐敗菌中，B2菌株的耐熱性最強。BOUKHRIS I 等發現解淀粉樣芽孢桿菌具有很強耐熱性[31]?？傊?，過熱蒸汽對4種小龍蝦優勢腐敗菌有較好的殺菌效果。過熱蒸汽處理（200 ℃，250 s；230 ℃，200 s）后，其殘活率均＜-8，殺菌效果均能達到近100%的致死率。

2.4 過熱蒸汽流量對小龍蝦腐敗菌殺菌效果的影響

過熱蒸汽溫度為200 ℃，不同過熱蒸汽流量的殺菌過程中，蒸汽流量對4 種優勢腐敗菌殺菌效果的變化趨勢與蒸汽溫度相似。其結果如圖4 所示，在殺菌初期，殘活率迅速減小。隨處理時間的延長，腐敗菌的殘活率變化逐漸變緩慢。擬合不同蒸汽流量對小龍蝦優勢腐敗菌的動力學曲線都呈帶有“拖尾”的曲線。通過過熱蒸汽（19 m3/h，300 s；24 m3/h，250 s；29 m3/h，200 s）處理后，小龍蝦優勢腐敗菌能被完全殺滅，其殺菌效果均能達到近100%的致死率。

圖3 在24 m3/h 蒸汽流量下殺菌處理小龍蝦產品優勢腐敗菌的存活曲線Fig.3 Survival curves of dominant spoilage bacteria from crayfish product after different 24 m3/h steam flow rate

圖4 在200℃蒸汽溫度下殺菌處理小龍蝦產品優勢腐敗菌的存活曲線Fig.4 Survival curves of dominant spoilage bacteria from crayfish product after different superheated steam flow rates,treatment time and 200 ℃ steam temperature

2.5 Weibull 模型參數及擬合評價

運用Weibull 模型擬合不同過熱蒸汽溫度、流量和殺菌時間因素下殺滅4 株小龍蝦優勢腐敗菌后殘活率的曲線。由表1 可知，Weibull 模型的R2≥0.935，表明Weibull 模型對過熱蒸汽滅活小龍蝦產品中優勢腐敗菌的所有動力學都具有較高擬合度。Weibul 模型因只有2 個參數b、n，具有一定的簡潔性、靈活實用性，可避免過度參數化[32]。尺度參數b反映過熱蒸汽參數與殺菌效果間相關性，形狀參數n反映曲線的形狀。由表1 可知，參數b隨著過熱蒸汽溫度、流量的增大而增大，說明過熱蒸汽參數與殺菌效果呈正相關，所以提高過熱蒸汽溫度和增大流量，更容易到達滅活腐敗菌的效果；參數n的值均小于1（表1），表明擬合曲線的形狀為先迅速下降，后趨于平緩，呈凹形。因此，延長殺菌時間并不能夠提高整個殺菌過程的殺菌效率[33]。為避免拖尾現象發生、提高過熱蒸汽殺菌效果和保障產品品質，過熱蒸汽對小龍蝦腐敗菌的殺菌過程應提高過熱蒸汽溫度、增大流量、縮短殺菌時間。

表1 Weibull 模型參數和R2Table 1 Weibull model parameters and R2

為衡量實際值與預測值的接近程度，以過熱蒸汽溫度、流量所有的實測值分別為橫坐標，模型預測值為縱坐標作圖，進行線性擬合，其結果如圖5所示。實測值與預測值越接近，其關系曲線的斜率a、決定系數R2均接近于1，截距b接近于0。由圖5 可知，過熱蒸汽溫度和流量的線性回歸方程分別為y=0.984 11x-0.090 6（R2=0.984 98）、y=0.978 6x-0.127 73（R2=0.979 31）。斜率a、截距b分別為a=0.984 11、0.978 6；b=0.090 6、0.127 73。斜率a、R2均接近1，截距b接近于0，說明Weibull 模型得到的預測值與實測值接近程度很高。

圖5 過熱蒸汽溫度和流量對小龍蝦腐敗菌殺菌效果的實測值和預測值的相關性Fig.5 Correlation between measured value and predicted value for inactivation effects of spoilage bacteria in crayfish by steam temperature and flow rate

2.6 殺菌機理初探

2.6.1 電導率及紫外吸收 細胞膜是維持細胞完整和細胞正常物質運輸、能量代謝的重要結構，當細菌的細胞膜受到破壞時，細胞膜失去控制物質運輸的功能，細胞內電解質大量外流，導致菌懸液的電導率升高。同時膜內小分子物質和核酸等大分子物質也隨之流出，這些核酸物質在波長260 nm 處有吸收[34]。因此通過測量菌懸液的電導率和260 nm吸光度的變化情況，了解菌體在過熱蒸汽處理后細胞膜的受損情況。從圖6-a 可知，0～ 40 s，菌懸液的電導率數值上升最快，40～ 250 s，菌懸液的電導率上升的速率比前40 s 緩慢。如圖6-b 所示，菌懸液在260 nm 的吸光度隨著過熱蒸汽處理時間延長呈不斷上升趨勢，先快速升高后平緩增加。電導率與吸光度的變化表明在過熱蒸汽處理40 s后菌懸液中已有大量菌體的細胞膜受到破壞[35]。電導率和紫外吸收的變化規律與小龍蝦產品優勢腐敗菌的存活曲線（圖3、圖4）具有一致性。在殺菌初始階段，大量優勢腐敗菌被殺滅，隨著過熱蒸汽處理時間延長，過熱蒸汽的殺菌速率變緩慢，最后趨于穩定。

圖6 小龍蝦產品優勢腐敗菌電導率和紫外吸收隨過熱蒸汽處理時間的變化Fig.6 The changes of conductivity and UV absorption of the dominant spoilage bacteria from crayfish product treated with superheated steam treatment time

2.6.2 細菌微觀形態的觀察 圖7 表示小龍蝦優勢腐敗菌蠟樣芽孢桿菌的微觀形態隨過熱蒸汽處理時間的變化。從圖7-A 觀察可知，未經過熱蒸汽處理的細胞具有規則的長桿狀，形態豐滿、完整、未變形，細胞表面光滑，無破裂，無內容物外泄現象。過熱蒸汽處理40 s（圖7-B）后，菌體保持較完整的桿狀，但細胞表面變粗糙，出現不規則的褶皺，表現為凹凸不平，同時存在內容物外泄現象，此時菌體形態已遭到破壞，細胞膜或細胞壁已破裂，導致菌懸液的電導率和紫外吸收數值的增加。過熱蒸汽處理150 s 和250 s 后（圖7-C 和圖7-D），菌體形態扭曲變形，菌體四周不完整，破損和斷裂嚴重，甚至有些菌體破裂成細胞碎片。結果表明，隨過熱蒸汽處理時間延長，改變了菌株外部形態，并對細菌的細胞壁膜造成不可逆的損傷，以及胞內物質外流，從而導致菌體死亡。

圖7 過熱蒸汽分別處理0、40、150、250 s 蠟樣芽孢桿菌的掃描電鏡圖Fig.7 Scanning electron microscopy of Bacillus cereus at different inactivation time with superheated steam

3 結論

采用稀釋涂布平板法，從腐敗的小龍蝦產品中分離出優勢腐敗菌，經重復劃線純化得到純菌落。根據優勢腐敗菌的16S rDNA 基因序列將其鑒定為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）和賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus macroides）。Weibull 模型能較好擬合過熱蒸汽溫度、流量和殺菌時間對熟制小龍蝦優勢腐敗菌的滅活動力學，其R2≥0.935。經過熱蒸汽處理后，4 種小龍蝦產品的優勢腐敗菌均能被完全殺滅。提高過熱蒸汽溫度和流量可以使過熱蒸汽對熟制小龍蝦腐敗菌的整體殺菌效果得到提升。同時通過對過熱蒸汽處理后菌懸液電導率和吸光度測量，以及對菌體微觀結構的觀察，表明過熱蒸汽殺菌使菌體細胞膜遭到嚴重變化，使細菌形態發生變化，造成胞內物質外流，致使腐敗菌死亡。本研究結果證實過熱蒸汽是在小龍蝦產品加工殺菌過程中一種有前途的殺菌技術。