海洋弧菌鑒定與分類相關功能基因研究進展

陳 星，唐金利，姜宮凌俠，亢振軍，李 楠

（1.南寧師范大學北部灣環境演變與資源利用教育部重點實驗室，廣西 南寧 530001；2.廣西大學生命科學與技術學院，廣西 南寧 530004；3.北部灣大學海洋學院，廣西 欽州 535011）

海洋弧菌（Vibrio）是一類菌體短小的異養型革蘭陰性細菌，兼性厭氧，廣泛分布于海水及海洋動物體內，多有好鹽性、運動性及氧化酶陽性，可在硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose，TCBS）瓊脂培養基上生長[1]。海洋弧菌中，重氮營氧弧菌（Vibriodiazotrophicus）、需鈉弧菌（V.natriegens）和海利斯頓氏菌（V.pelagius）等異養型固氮菌可將空氣中的氮分子還原成氨態氮，參與海洋無機氮循環[2]。多糖降解性弧菌可降解幾丁質等復雜糖類，可用于處理海洋污染物[1]。費希爾弧菌（V.fischeri）、哈維氏弧菌（V.harveyi）和火神弧菌（V.logei）等少數幾種以浮游、附存（含附著、寄生、腐生）和共生方式生活的弧菌可以發光，其發光程度與毒性濃度呈負相關關系，可用于水環境樣品的生物毒性檢測[3]。除有固氮、降解多糖、發光等能力外，以霍亂弧菌（V.cholera）、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、哈維氏弧菌、創傷弧菌（V.vulnificus）和溶藻弧菌（V.alginolyticu）為主的多種海洋弧菌還有致病性，除可感染魚蝦外，還可引發人類霍亂、胃腸炎和炎癥等多種疾病[4]。不同鹽度、深度、溶氧和pH 的海水中均有大量弧菌群，它們不僅在海洋生態系統元素循環中發揮重要作用，還關乎水產養殖發展和人類健康。

目前，弧菌科包含弧菌屬、發光桿菌屬、另類弧菌屬、腸弧菌屬、鹽弧菌屬、格里蒙氏菌屬、海膽單胞菌屬和鏈狀球菌屬等8 屬，150 多種[5-6]。早期的傳統表型鑒定分類方法是對弧菌進行純培養，再根據包括菌落形態、生理特征以及免疫學特性等弧菌表型進行分類鑒定。Vandenberghe 等[7-8]使用Biolog GN 系統對各類水產養殖生物體內所有分離物進行表型鑒定，發現弧菌屬是一個表型多樣化的群體，在不同生長周期與環境下呈現不同的表型和理化特征。隨著弧菌新種的增加，僅通過簡單的表型分類難以對弧菌科種類進行合理分類[8-9]。如豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae）通常被鑒定為河流弧菌（V.fluvialis）[10]，在未進行完整的形態特征篩選試驗時，嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）和類志賀毗鄰單胞菌（Plesiomonas shigelloides）會被誤認為是弧菌[11]。當前，TCBS 培養基是常用弧菌分離篩選培養基之一，Cleland 等[12]報道，海水、蛤和牡蠣樣品在TCBS培養基上分離出的53%的菌落可被鑒定為弧菌，Bolinches 等[13]從TCBS 培養基中挑取的83%的河口水樣分離株是弧菌。但有研究顯示，用表面熒光顯微鏡直接計數的活菌數始終高于相應的TCBS 平板計數，表明部分弧菌會進入不可培養狀態[14]。所以依靠表型鑒定的分類學方法僅針對可培養弧菌，卻無法有效篩選鑒定不可培養的弧菌類群。因此，人們開始轉向利用現代分子生物學方法。從20 世紀60 年代開始，分子生物學技術的迅速發展使弧菌分類學研究進入分子生物學時代，許多新技術和方法在弧菌分類學研究中得到廣泛應用?；【?6S rRNA 基因和其他功能基因等分子生物學方法已成為海洋弧菌分類鑒定的重要手段。筆者根據已有的弧菌分類學研究成果，闡述海洋弧菌鑒定與分類相關功能基因（表1）及其應用研究進展。

表1 常見功能基因的引物序列Table 1 Primer sequence of common functional genes

表1 續（Continued）

1 16S rRNA 基因

細菌的核糖體RNA 有3 種類型，即23S rRNA、16S rRNA 和5S rRNA，16S rRNA 基因為細菌、藍藻、放線菌和支原體等原核生物所共有，其功能同源且最為古老，既含有保守序列，又含可變序列。保守序列區可反映生物物種的親緣關系，為系統發育重建提供線索；可變序列區可揭示生物物種的特征核酸序列，是屬種水平鑒定的重要分子依據。16S rRNA 基因的序列長度約1 500 bp，分子大小適合操作，序列變化與進化距離相適應[43]。通過比較各類原核生物16S rRNA 基因的序列，利用序列差異計算它們之間的進化距離，可繪制系統進化樹，從而鑒定樣本中的分類信息[43]。Kim 等[44-45]從16S rRNA 基因序列中尋找弧菌屬保守但特異于其他菌屬的可變區位點，在該可變區位點設計創傷弧菌的特異性引物，建立一種檢測和鑒別創傷弧菌菌株的PCR 方法來代替傳統表型鑒定法。盡管16S rRNA基因的生物信息學提供了鑒定弧菌菌株較為客觀和可靠的方法，但它在種的水平上有一定局限性，16S rRNA 基因序列幾近相同也不能保證兩個弧菌菌株屬于同一物種[46]，因此，不能鑒定到種。人們開始嘗試用其他的功能基因和特異性毒力基因進行海洋弧菌的系統發育學分析，這些功能基因可與16S rRNA 基因相結合，對同屬不同物種作系統發育學分析。

2 管家基因（Housekeeping gene）

管家基因被認為是揭示高等分類學系統發育關系的潛在標記，可為弧菌系統發育結構尋找新的鑒定標記，提高弧菌分類的準確性。常用的弧菌物種鑒定基因分析方法包括擴增片段長度多態性（AFLP）、重復性外源回文元件PCR（rep-PCR）、DNA-DNA 雜交和多位點序列分析（MLSA），弧菌科的分類很快從使用單一基因發展到使用多個基因序列進行鑒定和系統發育分析[47]。例如，同時用8 個管家基因序列（ftsZ、gapA、gyrB、mreB、pyrH、recA、rpoA、topA）和16S rRNA 基因的MLSA 方案，為弧菌科鑒定和分類提供更高分辨率[48]。

2.1 recA

recA基因產物是一種多功能蛋白，有水解LexA阻遏蛋白的活性，最早發現于大腸桿菌（Escherichia coli），參與調控多種重要的細胞功能，包括同源重組、抗紫外線和X 射線以及SOS 修復DNA 損傷介導的突變[49]。Llyod 首先嘗試用recA進行系統發生學研究[50]。1995 年Eiesn[51]分別以recA和16S rRNA基因為系統學標記，從 Genbank 中選擇來自不同物種的DNA 序列，用相同NJ 建樹方法構建系統發生樹，發現二者的進化枝模式及分辨率極為相似，在系統發生樹的變形細菌（Proteobacteria）、棲熱菌屬（Thermus）和耐輻射異常球菌屬（Deinococcus radiodurans）等進化枝，recA分辨率優于16S rRNA基因。近年來，有研究表明recA基因作為系統學標記可有效地對弧菌屬進行種的鑒定，結果顯示，當弧菌菌株之間的16S rRNA 基因序列相似性大于98%時，弧菌recA基因之間的相似性為83%～ 99%，表明recA基因序列比16S rRNA 基因有更強的辨別力[52]。因此，相比于16S rRNA 基因，recA的某些區段有較高的物種專一性。

2.2 gyrB

gyrB基因常見于細菌中，編碼DNA 促旋酶B亞基蛋白，是一個單拷貝基因，也具有PCR 引物開發的保守區域，在DNA 復制過程中起重要作用[53]。gyrB基因序列已用于假單胞菌(Pseudomonades)[54]、分枝桿菌（Mycobacterium）[55]、小單孢菌（Micromonospora）[56]的分類研究，表明gyrB是一個合適的系統發育標記，也可用于研究弧菌物種水平的系統發育和分類學關系[35]。Luo 等[34]對9 株溶藻弧菌的gyrB片段（約1.2 kb）進行測序，并分析它們與其它相似弧菌的系統發育關系，發現所有溶藻弧菌在系統發育樹中分成一個強支持的簇，表明gyrB是溶藻弧菌成員鑒定和分類學分析的有效靶標，并成功開發了基于gyrB基因的PCR 方法。此外，gyrB基因也可與16S rRNA 基因序列結合進行燦爛弧菌（V.splendidus）相關菌株的系統發育分析[57]。副溶血弧菌和溶藻弧菌的16S rRNA 基因序列幾近相同，僅基于16S rRNA 基因的系統發育關系難以對物種進行鑒定分類，但將它們的gyrB基因之間的系統發育距離放大后則可鑒定為不同物種[35]。通過gyrB序列數據分析弧菌新分離株的系統發育位置，每一群弧菌新分離株均滿足序列多樣性的閾值標準，為弧菌不同種屬間的序列多樣性提供了新依據[35]。

rpoA和rpoB分別編碼RNA 聚合酶的α 亞基和β 亞基，核糖核酸亞基通過二聚作用啟動α 聚合酶的組裝，形成β 亞基相互作用的平臺[58]。該序列比16S rRNA 基因進化更快，目前已有學者提出rpoB基因序列可作為細菌鑒定方法[59]，已被認為適合于區分衣原體（Chlamydia）[60]、大腸桿菌（Escherichia coli）[61]和乳桿菌（Lactobacillus）[62]，并用于鑒定許多分類群中的細菌分離物，包括假單胞菌屬(Pseudomonas)[63]、棒狀桿菌（Corynebacterium）[64]和葡萄球菌（Staphylococcus）[65]。此外，該基因還可用于弧菌的分類鑒定，Dalmasso 等[40]通過設計rpoA的特異性引物，比對所有弧菌屬的rpoA基因序列，建立一種基于rpoA基因的弧菌屬PCR 檢測方法，并引入靶向16S rRNA 基因的細菌特異性引物作為非競爭性內部擴增對照來消除假陰性結果，結果表明，該rpoA和16S rRNA 基因結合的PCR檢測方法專屬性強、快速、可靠，為分離菌落中弧菌屬的鑒定提供一種常規的篩選技術[40]。對于rpoB基因，Ki 等[41]通過對從沿海水域分離到的29 株表型不同的弧菌進行rpoB和16S rRNA 基因序列測定以及系統發育比較成功將29 株菌劃分為11 個不同的種，表明rpoB在弧菌屬系統發育樹上的分辨率約為16S rRNA 基因的3 倍。多重PCR 主要針對保守管家基因的變異，Tarr 等[42]建立一個弧菌的rpoB參考數據庫，確定rpoB基因的870 bp 部分核苷酸序列，并結合其他管家基因，鑒定無法基于表型或多重PCR分類的弧菌分離物，認為多重PCR和rpoB的組合測序可快速準確地鑒定出對人類有致病性的主要弧菌物種，rpoB可為弧菌屬的其他種提供鑒定工具。

2.4 pyrH

pyrH是編碼鳥苷酸激酶的管家基因，參與生物體內嘧啶核苷酸從頭合成重要嘧啶代謝活動，一般與rpoA、recA等管家基因聯合作為分子標記，在弧菌鑒定中起重要作用[37]。Thompson[39]利用rpoA、recA和pyrH的分子標記位點，包括16S rRNA 基因構建的系統發育樹均與以往的多相分類研究基本一致，從而確定三個位點間的種間變異，發現弧菌種（Vibriospp.）、發光細菌（Photobacteria）、腸弧菌（Enterovibrio）和鹽弧菌（Salinivibrio）在各分子標記位點上均有不同程度的分化，每個物種明顯地形成了依基因序列相似性而分開的簇，同一弧菌屬的不同菌株rpoA、recA和pyrh基因序列的一致性分別為98%、94%和94%，說明這三個基因位點在物種間的區分能力比16S rRNA 基因序列更強?；魜y弧菌和擬態弧菌（Vibriomimicus）的表型和基因組相似，兩者難以快速分離鑒定，但同時利用管家基因pyrh、recA和rpoA的特定序列對45 株來自不同地理區域和寄主的代表性菌株進行檢測，發現霍亂弧菌和擬態弧菌在每個基因的基礎上形成了單獨的種群，同時在這三個位點上，擬態弧菌比霍亂弧菌有更多的異質性，其中pyrH基因對區分霍亂弧菌和擬態弧菌的分辨率最高[66]。這些結果表明，采用rpoA、recA和pyrh基因的多位點序列分析方法可用于這兩種弧菌的鑒定。此外，González-Castillo 等[67]除利用16S rRNA 基因和管家基因pyrH的測序外，還通過包括表型特征以及DNA-DNA雜交多相分類學方法，分離鑒定出Vibrio toranzoniae。

3 毒力基因（Virulence gene）

弧菌通常由于其毒力基因的表達而具有致病性，在水產養殖和疾病診斷中，致病性弧菌的快速檢測顯得尤為重要，然而毒力菌株的生長特性并不明顯，且與其他細菌相比，它們的種群數量極低，所以傳統的培養方法難以在臨床和食品樣品中檢測到毒力菌株[68]。因此基于毒力基因的PCR 測定法在鑒定弧菌病原體的特異性標記物方面有較高的應用價值。

3.1 tdh、trh 和tlh

溶血素（hemolysin）是一種外毒素，可攻擊血細胞膜并導致細胞破裂，可能是致病性弧菌中分布最廣的毒素，在感染過程中發揮多種作用。而編碼熱穩定直接溶血素 (thermostable direct hemolysin)、熱穩定直接溶血素相關溶血素（thermostable direct hemolysin-related hemolysin）和不耐熱溶血素（thermolabile hemolysin）的毒力因子基因tdh、trh和tlh與人類病原體副溶血弧菌的毒力強烈相關，被認為是副溶血弧菌的特征分子標記，也是最簡單和最常用的致病性診斷基因[16]。針對三種溶血素基因tlh、tdh和trh的多重PCR 方法已用于檢測墨西哥灣海水中的副溶血弧菌，tlh基因是種特異性的標記物，而tdh和trh基因是致病性菌株的標記基因，結果顯示三種靶向基因具有高度特異性，58%的牡蠣樣品有tlh陽性，表明存在副溶血弧菌，而58%的牡蠣樣品中21%為tdh陽性，0.7%為trh陽性，表明存在牡蠣樣品中的副溶血弧菌是致病性菌株[16]。2010 年還報道了同時針對tlh、tdh和trh三種靶基因的單一反應，利用SYBRGreenTM的實時聚合酶鏈反應檢測貝類和海灣水中總副溶血弧菌和致病性副溶血弧菌，該方法快速、特異、敏感和經濟高效，有助于減少與海產品相關的副溶血弧菌疾病暴發[16]。需要指出的是，因為在一些非致病性菌株中并不存在這些毒力基因，這意味著這些毒力基因不能作為所有副溶血弧菌的特異性靶標，因此，準確鑒定副溶血弧菌需要更新和更準確靶標。

3.2 toxR

toxR基因雖然廣泛分布于弧菌科細菌，但在不同弧菌中調控機制不盡相同。toxR基因最先在霍亂弧菌中發現，由它編碼的跨膜轉錄調控蛋白ToxR參與調控霍亂弧菌的一些主要毒力基因和外膜蛋白的表達[69-70]。在創傷弧菌中的ToxR 蛋白可正調控高毒性溶血素vvh 基因的表達，使其表達量提高五倍[71]。而編碼副溶血弧菌的主要致病因子——熱穩定直接溶血素的tdh基因也受ToxR 蛋白調控[72]?；魜y弧菌、副溶血弧菌和創傷弧菌之間toxR基因核苷酸序列的相似性為50%～ 60%[69,71-72]。這種在弧菌科中廣泛分布而種間相似性較低的特性使toxR基因成為弧菌科菌種鑒定的良好分子靶標。Franco等[73]采用PCR 方法擴增哈維氏弧菌的toxR基因片段，其序列分析和比對結果表明，哈維氏弧菌toxR基因與副溶血弧菌的toxR基因序列同源性為87%，與河流弧菌（Vibrio fluvialis）的同源性為84%，與創傷弧菌的同源性為83%，與坎氏弧菌（Vibrio campbellii）的部分序列相似；與16S rRNA 基因相比，toxR基因的系統發育樹差異更大，易將哈維氏弧菌、坎氏弧菌和副溶血弧菌區分開。另外，將toxR基因序列和毒力基因（tdh和trh）結合，有助于快速檢測從臨床標本中分離的疑似副溶血弧菌菌株，從而特異性鑒定副溶血弧菌[24]。Fu 等[74]建立了一種基于環介導的等溫擴增（LAMP）技術的快速診斷方法，對靶向溶藻弧菌的toxR基因進行引物設計，成功鑒定來自105 種不同細菌分離物的93 種溶藻弧菌菌株，并通過16S rRNA 基因測序證實它們的同一性。

3.3 ctxA 和hlyA

霍亂毒素和溶血素是霍亂弧菌產生致病性的主要原因，ctxA和hlyA是產生這兩種毒素的編碼基因，通過PCR 擴增霍亂毒素A 亞基基因（ctxA）的部分片段（564 bp）可鑒定產毒霍亂弧菌O1 類群菌株[75]，亦可與ctxA毒素調節因子基因（toxR）、60 ku 伴侶蛋白產物基因（groEL）等其他多種致病相關基因結合作為檢測的靶序列，對各種環境水樣中產毒霍亂弧菌進行快速檢測和鑒定[76]。此外，Shangkuan 等[77]用擴增ctxA2-B 基因片段的引物和針對hlyA基因的三個引物建立了多重PCR 技術，用于產毒素霍亂弧菌和O1 型霍亂弧菌的鑒定。

4 其他基因

Wang 等[78]以編碼毒力調節蛋白irgB的基因為目標，建立了針對irgB、tdh和trh基因的多重PCR檢測副溶血弧菌分離株和毒力菌株的方法，結果表明，irgB基因是一種新的、有效的副溶血弧菌檢測標記。hsp60基因可作為海洋弧菌系統發育分析和物種鑒定的一個有用的替代目標，以補充更常規的鑒定系統[11]。hsp60基因在不同弧菌種屬間的序列同源性為71%～ 82%，同種弧菌菌株之間的序列同源性為96%～100%，可明確區分目前研究中的絕大多數弧菌物種，以及經常被傳統的生化方法誤認為是弧菌的嗜水氣單胞菌和類志賀毗鄰單胞菌[11]。編碼熱休克蛋白的groESL在細菌中普遍存在且高度保守，groESL基因中的基因間隔區（ISR）不僅可檢測弧菌種，還可特異性地檢測副溶血弧菌和創傷弧菌[79]。與其他管家基因相比，dnaJ基因在區分溶珊瑚弧菌（Vibriocoralliilyticus）和海神弧菌（Vibrio neptunius）、哈維氏弧菌和半滑舌鰨病原菌輪蟲弧菌（Vibrio rotiferianus）方面優于recA和rpoA，可作為鑒定弧菌種類的新工具[80]。Nhung 等[81]還利用dnaJ基因建立了一種適用于常規診斷實驗室的PCR 方法，用于鑒定霍亂弧菌、副溶血弧菌、創傷弧菌、擬態弧菌和溶藻弧菌等5 種人類病原體；除這5 種弧菌和非弧菌菌株外，其他所有菌株均無特異性PCR 片段。Machado 等[69]利用基于103 個弧菌科菌株基因組的數據平臺，發現fur基因的種內相似性大于95%，與16S rRNA 基因和MLSA 分析結果一致，證明fur基因在鑒定弧菌科物種中的高分辨率及其作為一個系統發育標記的作用。fur基因系統發育能力的發現和PCR 方法的發展可用于該基因的擴增和測序，無論是單獨使用，還是和MLSA中的位點一起使用，都是人們普遍關注的問題。除上述功能基因外，還有tnaA、vhhA和luxR等基因正在逐漸被用于海洋弧菌的鑒定分類[28,82-83]。

5 展望

16S rRNA 基因的分子鑒定技術已較成功地用于弧菌分類鑒定，但該方法在特定情況下無法很好地鑒定弧菌種間差異。目前，一般采用recA、gyrB、pyrH等管家基因，tdh、tlh、trh等毒力基因和16S rRNA 基因相結合進行特定弧菌的系統鑒定與分類研究。此外，近年來，MLSA 技術分子等標記技術也常用于弧菌種類鑒定，盡管提高了弧菌屬系統發育的分辨率，但此類技術需進行多個位點擴增和測序，不僅提高了研究成本，其鑒定結果也存在一定誤差?；蚪M測序技術的快速發展和微生物基因組大數據的爆炸式增長將更有利于研究人員針對弧菌基因組信息，深入發掘可用于弧菌分類鑒定的功能性基因和管家基因資源，通過不斷探索新型基因分子靶標和特異性引物，實現弧菌屬精準鑒定，完善分類系統，從而促進海洋弧菌的多樣性研究?？傊?，傳統的弧菌檢測方法，已無法滿足當前海洋弧菌的多樣性研究和致病性弧菌的監測和防控工作需要，采用PCR 技術，研發新型特異種屬的功能基因檢測勢在必行。