海洋土曲霉C23-3 與不同類型海洋微生物共培養對其次生代謝產物的影響

梁金月，李文卿，楊靜明，劉亞月，聶影影，楊文聰，張 翼,2

（1.廣東海洋大學食品科技學院// 廣東省水產品加工與安全重點實驗室// 廣東省海洋生物制品工程實驗室// 廣東省海洋食品工程技術研究中心//水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室// 湛江市腦健康海洋藥物與營養品重點實驗室// 廣東海洋大學海洋藥物研究所，廣東 湛江 524088；2. 廣東海洋大學深圳研究院，廣東 深圳 518120）

遼闊深邃的海洋占地球表面積約70%，其中蘊藏著高度的生物多樣性和豐富的天然產物資源[1]，海洋真菌等海洋微生物為適應海洋高鹽、高壓、低溫、寡營養等有別于陸地的多樣化生境和激烈的生存競爭，進化出可產生多樣化生物活性次生代謝產物的潛力，如較早發現的頭孢霉素C已衍生出龐大的頭孢霉素家族，環孢霉素A則被用于免疫抑制劑，越來越多的抗腫瘤活性物質也在海洋真菌中被發現，海洋真菌正日益受到科研人員的重視[2]。然而脫離了自然生境的海洋真菌等微生物，在實驗室人工培養條件下大部分次級代謝產物途徑并不能充分表達，有研究表明通過接觸性或非接觸性的共培養方法，能夠利用微生物種群之間的協同代謝或誘導作用，有效激活這些沉默表達途徑，從而提高微生物次生代謝產物的產量以及多樣性[3]。如OH等[4]將一株海洋真菌Libertella（CNL-523）與一株海洋細菌aproteobacterium（CNJ-328）共培養，從共培養提取物中分離純化得到4個新化合物，分別為libertellenones A-D；OH 等[5]將一株海洋真菌Emericellasp.和一株海洋放線菌Salinispora arenicola共培養，從共培養提取物中得到2個新化合物emericellamides A和B。董杰杰等[6]將海洋真菌Aspergillussp.SCSGAF 0076與細菌Bacillussp.MNMCCE 001共培養，發現共培養提取物中的抗菌活性化合物青霉酸以及紅色素含量均比Aspergillussp.SCSGAF 0076純培養時高。這些表明共培養是一種激活沉默次生代謝途徑的有效手段。

土曲霉(Aspergillus terreus)屬于子囊菌門(Ascomycota) 散囊菌綱(Eurotiomycetes) 散囊菌目(Eurotiales)發菌科(Trichocomaceae)曲霉屬(Aspergillus)，是廣泛存在于海洋和陸地的一種真菌[7]。丁內酯和土震素類化合物是土曲霉次級代謝產物中的代表性化合物，研究發現丁內酯類化合物具有良好抗炎[8-9]、神經元保護[10]、抗氧化[11]以及抗菌[12]等作用，土震素類化合物具有強的乙酰膽堿酯酶抑制活性[13]，考慮到乙酰膽堿酯酶抑制劑仍是迄今臨床阿爾茲海默癥藥物的主流，而大腦氧化應激在阿爾茲海默癥發展過程中發揮了廣泛作用[14-15]，故土曲霉次生代謝產物的研究對于尋找抗阿爾茲海默病的先導化合物具有一定研究價值。

本實驗室在前期研究中發現一株南海珊瑚來源的海洋真菌土曲霉C23-3 的代謝產物具有一定的抗菌、抗氧化及乙酰膽堿酯酶抑制活性，并發現其可產生特征性次生代謝產物丁內酯-I[7,15]。本研究選用該菌株分別與海洋真菌膠紅酵母、海洋細菌枯草芽孢桿菌（革蘭陽性，G+）和副溶血弧菌（革蘭陰性菌，G-）等3 種類型微生物進行共培養，研究共培養對次生代謝的影響，以期誘導土曲霉C23-3產生更高產或更豐富的丁內酯類等活性次生代謝產物，為尋找具有抗阿爾茲海默病等活性的先導化合物提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與試劑 多功能紫外透射儀WFH-201B（上海精科實業有限公司）、電熱恒溫培養箱HPX-9082MBE（上海博訊實業有限公司）、高效液相色譜儀1260 Infinity Ⅱ（美國安捷倫科技有限公司）、分析天平ME204E（德國梅特勒托利多公司）、酶標儀Epoch2（美國伯騰儀器有限公司）、超聲波清洗機300ZED（昆山禾創超聲儀器有限公司）、旋轉蒸發儀R-300（瑞士步琦公司）、全自動高壓滅菌鍋IRM-100（德國愛安姆公司）、生物安全柜BSC-1300 II A2（上海博訊實業有限公司）。

碘化硫代乙酰膽堿(Acetylthiocholine，ATCI)，sigma，DA0048；5，5-二硫代二硝基苯甲酸(Dithiobisnitrobenzoicacid，DTNB)，Ruibio，D8130；乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)，Sigma，C3389；牛血清白蛋白(BSA)，Sigma，A1933；二苯代苦味酰自由基(1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl,DPPH)，Sigma，D9132；GF254 硅膠高效薄層層析板購自德國默克公司；海鹽（湛江海之儀有限公司），酮康唑（≥98%）和氨芐青霉素鈉（≥98%）購自上海阿拉丁試劑公司；二甲基亞砜、甲醇、超純水、三氯化鐵、鐵氰化鉀均為國產分析純試劑，高效液相色譜分析用甲醇為色譜甲醇。

1.1.2 生物材料 海洋真菌土曲霉Aspergillus terreusC23-3（GDMCC No.60316）采自湛江徐聞珊瑚保護區，現保存于廣東省微生物菌種保藏中心；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisMCCC 1A03710）購自中國海洋微生物菌種保藏中心；副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）由廣東海洋大學水產學院溫崇慶教授贈予；膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）由廣東海洋大學徐春厚教授贈予。

1.1.3 培養基配制 大米固體培養基：糙米50 g、質量濃度2%半人工海水60 mL；海水馬鈴薯蔗糖固體培養基：500 mL 的馬鈴薯汁、蔗糖20 g、蛋白胨5 g、海鹽20 g、加入蒸餾水定容至1 L，pH＝7.2± 0.2；沙氏培養基：蛋白胨10 g、葡萄糖40 g、瓊脂20 g、純水定容至1 L，pH＝5.6 ± 0.2；MH 肉湯培養基：牛肉膏5 g、可溶性淀粉1.5 g、酪蛋白水解物17.5 g、瓊脂20 g、純水定容至1 L，pH＝7.2～7.4；海生菌瓊脂培養基2216E：酵母膏1 g、蛋白胨5 g、瓊脂16 g、粗海鹽20 g、純水定容至1 L。酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養基YPD：酵母膏10 g、葡萄糖20 g、蛋白胨20 g、瓊脂20 g、粗海鹽20 g、純水定容至1 L。

1.2 方法

1.2.1 菌株次生代謝產物的TLC 分析 參照文獻[16]，以氯仿：甲醇(V/V=7∶1)為TLC 展開劑，記錄254 nm 和365 nm 紫外圖像，DPPH 自由基清除活性自顯影圖像（若物質具有活性，則呈明顯斑點，非活性部分顯紫色），乙酰膽堿酯酶抑制活性自顯影圖像（白色為活性部分，其余部分為黃色），茴香醛硫酸顯色及鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色圖像。

1.2.2 菌株純培養與提取 將已經活化的枯草芽孢桿菌、副溶血性弧菌、膠紅酵母和土曲霉C23-3切塊分別置于裝有大米固體培養基的500 mL 錐形瓶中培養，12 d 時，取1/4 的大米培養基，用150 mL甲醇超聲提取、過濾、濃縮得粗提物；余下的3/4繼續培養至24 d 時用450 mL 甲醇超聲提取、過濾、濃縮得粗提物，均設置2 個平行試驗。

1.2.3 活菌株與土曲霉C23-3 共培養與提取 在超凈臺中，用移液槍各取10 mL 枯草芽孢桿菌、副溶血弧菌和膠紅酵母的菌液分別接種于已滅菌的大米培養基中，28 ℃培養4 d 后再分別放入土曲霉C23-3菌塊進行共培養；12 d 時，取1/4 的大米培養基，用150 mL 甲醇超聲提取、過濾、濃縮得粗提物；余下的3/4 繼續培養至24 d 時用450 mL 甲醇超聲提取、過濾、濃縮得粗提物，試驗均設置2 個平行。

1.2.4 滅活菌體與土曲霉C23-3 共培養與提取 在超凈臺中，用移液槍各取10 mL 枯草芽孢桿菌、副溶血弧菌和膠紅酵母的菌液分別接種于已滅菌的大米培養基中，在28 ℃培養4 d 后于121℃滅菌21 min 得到已滅活的各菌株菌體，最后再分別放入土曲霉C23-3 菌塊進行共培養；12 d 時，取1/4 的大米培養基，用150 mL 甲醇超聲提取、過濾、濃縮得粗提物；余下的3/4 繼續培養至24 d 時用450 mL 甲醇超聲提取、過濾、濃縮得粗提物，試驗均設置2 個平行。

1.2.5 HPLC 分析 將培養時間相同的不同培養條件下得到的各提取物用適量同樣體積的甲醇溶解，過0.22 μm 的微孔濾膜，供檢測用。

Agilent C18色譜柱(4.6 mm × 150 mm，4 μm)，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30℃，進樣量為10 μL，檢測波長254 nm；流動相梯度條件為0～ 30 min:由體積分數10%甲醇～ 90%水梯度洗至100%甲醇；30～ 40 min:甲醇/水＝100%～ 100%；40～ 45 min:甲醇/水＝100%～10%；45～ 50 min:甲醇/水＝10%～10%。

1.2.6 抗菌試驗 采用濾紙片法進行抗菌試驗，將培養基倒至平板中，待培養基凝固后，吸取100 μL 0.5 麥氏濁度的菌液，用涂布棒均勻涂布在固體平板上，將負載有待測樣品的6 mm 濾紙片(每個濾紙片負載200 μg 待測樣品）用鑷子緊貼在平板表面，氨芐青霉素鈉和酮康唑用于陽性對照(每個濾紙片負載10 μg 氨芐青霉素鈉或酮康唑），然后把平板倒置于4℃約10 h，后將真菌平板置于28℃培養箱、細菌平板置于37℃培養箱中培養13 h，記錄抑菌圈直徑大小，每個實驗做2 個平行。

2 結果與分析

2.1 菌株培養的表觀形態對比 如圖1 所示，菌株土曲霉C23-3 在生長前期呈白色，隨著培養時間的增加顏色由白色變為深棕色（J1-J3）?？莶菅挎邨U菌隨著培養時間的增加菌株由原來的淺黃色變為棕黃色，菌體生長也越來越旺盛（A1-A3），枯草芽孢桿菌與土曲霉C23-3 共培養（C1-C3），枯草芽孢桿菌呈深棕色，土曲霉C23-3 呈白色；副溶血弧菌隨著培養時間增加顏色由淺黃色變為深黃色（D1-D3），當副溶血弧菌與土曲霉C23-3 共培養至12 d 白色的土曲霉幾乎把整個大米培養基覆蓋（F1-F3）。膠紅酵母隨著培養時間的增加由淺紅色變為深紅色（G1-G3），當膠紅酵母與土曲霉C23-3共培養時（I1-I3），可觀察到這2 種真菌都有生長。

圖1 菌株在不同培養時期的生長形態Fig.1 Growing morphology of strains during different cultured periods

2.2 粗提物TLC 自顯影活性成分分析 將發酵粗提物用同樣體積甲醇溶解，以玻璃毛細管定量點樣到GF254 硅膠高效薄層層析板上，進行TLC 紫外及顯色分析，對比不同培養條件下代謝產物的TLC指紋圖譜（圖2）可知土曲霉在不同共培養條件下均能產生丁內酯-I，由圖2-A4可知，不同滅活菌體與土曲霉C23-3 共培養提取物中丁內酯-I 斑點比對應活菌與土曲霉C23-3 共培養提取物中丁內酯-I 斑點明顯大，這表明在培養12 d 時滅活菌體與土曲霉C23-3 共培養所產生的丁內酯-I 含量比活菌與土曲霉C23-3 共培養產生的丁內酯-I 多。由圖2 中的B4、D4和E4可知，副溶血弧菌滅活菌體與土曲霉C23-3共培養提取物中的大極性（Rf＜0.4）熒光斑點物質、大極性（Rf＜0.3）抗氧化成分和酚胺類物質明顯比土曲霉C23-3 純培養提取物更加豐富多樣；由圖2中的B5、D5和E5可知，副溶血弧菌與土曲霉C23-3共培養提取物和副溶血弧菌滅活菌體與土曲霉C23-3 共培養提取物中的大極性（Rf＜0.4）熒光斑點物質、大極性（Rf＜0.4）抗氧化成分和酚胺類物質比土曲霉C23-3 純培養提取物豐富多樣；由圖2中的F4和F5可知，枯草芽孢桿菌與土曲霉C23-3共培養提取物中大極性（Rf＜0.2）乙酰膽堿酯酶抑制成分比土曲霉C23-3 純培養提取物豐富；由圖2-E5中可知枯草芽孢桿菌與土曲霉C23-3 共培養提取物和枯草芽孢桿菌滅活菌體與土曲霉C23-3 共培養提取物中的酚胺類物質比土曲霉C23-3 純培養提取物豐富。這些表明不同形式的共培養均可激活微生物的次生代謝，產生更豐富的活性物質。

圖2 粗提物的薄層層析紫外、化學顯色及TLC 生物自顯影圖像Fig.2 The UV,chemically colorization and TLC bioautography images of the extracts

2.3 抗菌活性 濾紙片法發現副溶血弧菌、枯草芽孢桿菌和膠紅酵母純培養提取物對土曲霉沒有明顯的抑菌活性，而土曲霉純培養提取物對副溶血弧菌、枯草芽孢桿菌或膠紅酵母均有顯著抑菌效果（表1），抑菌圈平均直徑均在18.0 mm 以上，這表明在共培養過程中，副溶血弧菌等添加菌在化學拮抗競爭方面處于劣勢，而土曲霉在此方面為優勢。

表1 各粗提物的抗菌生物活性Table 1 Antimicrobial activities of the extracts mm

而共培養物的活性表現顯示，副溶血弧菌與土曲霉C23-3 共培養12 d 的提取物對副溶血弧菌的抑菌圈為11.3 mm，而培養24 d 時抑菌圈有18.3 mm；這說明在早期共培養下，較早在培養基上定植的副溶血弧菌有一定的生長，后接種的土曲霉生長受到抑制，可能存在營養競爭關系，但在培養后期副溶血弧菌生長受到土曲霉較強的抑制。而副溶血弧菌滅活菌體在與土曲霉共培養過程中，提取物的抗菌活性從12 d 時的18.0 mm 減弱到24 d 時的16.7 mm，這可能是由于其誘導物質具有一定的半衰期。上述現象在枯草芽孢桿菌滅活/活菌體與土曲霉共培養的實驗中也被觀察到，其滅活菌體對共培養物抗菌活性刺激作用的衰減尤為明顯，從12 d 的20.7 mm 抑菌圈減弱到24 d 的12.0 mm。膠紅酵母的滅活菌體對共培養物抗菌活性刺激作用隨時間也有一定衰減，但活菌體與土曲霉的共培養物一直具有穩定且顯著的抗膠紅酵母活性，這表明在共培養體系中，膠紅酵母一直處于受抑制的劣勢。

2.4 HPLC 指紋圖譜分析 利用HPLC 對各培養發酵代謝產物進行分析，共培養物中某微生物的特征代謝產物的存在與否及其產量可反映在共培養體系中2 種菌此消彼長的生長態勢，這與上文中的培養提取物抗菌活性結果可互為印證。

由圖3 中的A6、C6和D6可知，當培養12 d 時，其純培養對應的特征代謝產物在活副溶血弧菌與土曲霉共培養體系中仍然存在，但產量明顯低于純培養物中的含量，這表明在共培養體系中弧菌有一定生長；同樣，土曲霉的特征代謝產物丁內酯-I 產量低于純培養對照說明其在共培養體系中的生長也受到抑制，雙方存在營養或化學競爭，這與上文抗菌活性揭示的信息一致，考慮到丁內酯-I 的抗菌作用[12]，推測該化合物參與了土曲霉對共存菌的化學拮抗。值得注意的是，色譜峰面積顯示滅活弧菌和土曲霉共培養體系中丁內酯-I 的產量比土曲霉純培養高2.2 倍，比活弧菌-土曲霉共培養高7.8 倍。類似菌株生長競爭及滅活菌體更能促進土曲霉產丁內酯-I 的現象在枯草芽孢桿菌和膠紅酵母與土曲霉的培養實驗中也被觀察到。

當培養至24 d 時，由圖3 中的E6、G6和H6可知共培養體系中副溶血弧菌長勢較弱，這與抑菌活性結果一致，而滅活/活菌兩種共培養方式都無明顯誘導土曲霉產生更多丁內酯-I 效果，這表明原來起作用的誘導物質可能已經失效?？莶菅挎邨U菌在此時間點也有類似現象；而圖3-E7顯示了其純培養24 d 時有丁內酯-I 色譜峰（由其保留時間16.9 min及紫外光譜確認），由于該化合物為典型的真菌代謝產物，推測此峰是樣品提取時污染所致。而由圖3-G8和圖3-H8可知，在此時間點，膠紅酵母的活菌更能刺激土曲霉中丁內酯-I 的產生，是土曲霉純培養的1.4 倍。

另外，結果也顯示，除了丁內酯-I 之外，共培養對于其他一些成分包括微量成分的產生也具有刺激作用。如培養12 d 時，保留時間1.2 min、1.9 min及11.4 min（經紫外光譜比較也為丁內酯類代謝產物）的峰在滅活弧菌菌體與土曲霉共培養物中的含量要顯著高于活弧菌與土曲霉共培養以及土曲霉純培養物，而該物質在弧菌純培養中并不存在，這表明弧菌菌體信號物質激活了土曲霉中這些產物的代謝途徑。而膠紅酵母在12 d 及24 d 時，保留時間7.5 min 的峰在活酵母與土曲霉共培養體系中的含量要遠高于滅活酵母與土曲霉共培養、土曲霉純培養及酵母純培養，值得注意的是在24 d 時，膠紅酵母純培養中也有少量該物質產生，說明該物質可能是酵母菌和霉菌兩類真菌都可產生的物質，但活菌體相互作用大大促進了該物質產生。

圖3 254 nm 下各粗提物的HPLC 指紋圖譜Fig.3 The HPLC fingerprints recorded at 254 nm of the extracts

3 討論

海洋微生物為適應高鹽、低壓、低營養等特殊生態環境，會產生結構新穎、活性顯著的化合物，但在實驗室培養條件下有些海洋微生物產生次級代謝產物的途徑不表達或者表達被抑制[3]，科研人員為最大程度開發利用海洋微生物等天然資源，通過有效微生物共培養技術獲得生物活性更顯著、化學成分更豐富的次生代謝產物。如朱峰等[17]將來自南海紅樹植物的2 株內生海洋真菌共培養，從共培養提取物中提取分離到化合物2-甲基水楊酸和環（苯丙-苯丙）二肽，這2 種化合物在純培養時未能得到。丁維嘉等[18]將來自南海紅樹林的內生真菌E33 和K38 共培養，從中分離純化得到9 種化合物，其中的6 種化合物在純培養時未能分離得到。Chen等[19]將一株淡水湖泊沉積物真菌土曲霉（Aspergillus terreus）分別與枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌進行蒸餾水大米培養基上的共培養，發現共培養代謝產物中的真菌化合物 butyrolactones I-VI、terrein 和aspulvinone E 等12 個已知化合物產量相比真菌土曲霉純培養時提高34 倍，且從共培養提取物中得到2 個新化合物isobutyrolactone II、4-O-demethylisobutyrolactone II 和1 個已知化合物N-(carboxymethyl)anthranilic acid，其中N-(carboxymethyl)-anthranilic acid 只在共培養條件下檢測到，在真菌土曲霉單獨培養時并沒有檢測到。

而本研究同時選取枯草芽孢桿菌（G+）、副溶血弧菌（G-）和膠紅酵母（酵母樣真菌）等3 種不同類型的耐鹽菌株與海洋來源土曲霉在海水大米培養基中進行了共培養。發現1 個值得注意的現象，即將死的菌體（滅活的枯草芽孢桿菌、副溶血弧菌或膠紅酵母）與土曲霉C23-3 共培養組時，相較于活菌體與土曲霉C23-3 共培養組以及土曲霉純培養組，在培養至12 d 時土曲霉特征代謝產物丁內酯-I的產量，滅活菌體與土曲霉共培養組 ＞ 土曲霉純培養組 ＞ 活菌體與土曲霉共培養組。推測滅活菌體中存在的某些信號物質能在一定時間內穩定存在并誘導土曲霉增強丁內酯-I 的產生，而活菌在此時間段內與土曲霉共培養時可能由于營養競爭等關系抑制土曲霉的生長及丁內酯-I 的合成。但當共培養時間延長至24 d 時，滅活菌體對于土曲霉產丁內酯-I 的影響因菌而異，或與活菌體效果接近（副溶血弧菌、枯草芽孢桿菌），或更弱（膠紅酵母），推測與不同菌產生的誘導物質的半衰期或菌對大米培養基的生長適應性等有關。有前人報道丁內酯-I 是土曲霉的一種群體自感應信號分子，在菌絲生長后期具有促進孢子形成的作用[20]，對比本實驗中12 d 的土曲霉純培養物與死弧菌/芽孢桿菌/酵母菌和土曲霉的共培養物外觀形態，可發現后者的孢子產量（棕色）要明顯高于前者，這表明滅活菌體中的誘導物可能向土曲霉傳遞了類似“惡劣環境”的信息，土曲霉進一步通過分泌丁內酯增強了群體感應作用并產孢抗逆。

另外，也發現共培養對于其他代謝產物包括一些微量成分的產生也有較顯著的激活作用，但添加枯草芽孢桿菌共培養誘導土曲霉次生代謝的整體效果沒有上述Chen 報道的顯著，這可能與所用的土曲霉及枯草芽孢桿菌菌株水平上的差異，以及培養的大米培養基成分（如鹽度、大米種類）、發酵時間、溫度等因素有關。

4 結論

本研究中TLC、活性自顯影及HPLC 指紋圖譜均顯示不同類型的微生物與土曲霉共培養均可激活一些原本沉默的活性次級代謝產物。

在活菌共培養體系中，枯草芽孢桿菌、副溶血弧菌及膠紅酵母在與土曲霉的化學拮抗中均處于劣勢；而滅活菌體相對于活菌，在12 d 時對土曲霉特征代謝產物也是群體自感應信號分子丁內酯-I 的產生具有更強作用，而更長時間的死菌刺激優勢不明顯或減弱，這可能源于某些具有一定半衰期的信號物質，對于控制合適時間點以更有效進行誘導調控發酵提供了有益啟示。推測這些物質是菌體滅活時產生的，但具體分子結構還有待深入研究。

除了形態觀察外，菌株化學拮抗能力及HPLC指紋圖譜變化也可為揭示共培養體系中菌株之間的消長態勢提供豐富的信息，是共培養體系研究的有用化學手段。

綜上所述，本研究為進一步挖掘海洋真菌潛力及抗老年癡呆等活性先導化合物的發現提供了基礎。