鹽酸普魯卡因誘導下海洋真菌Hypocrea lixii次級代謝化學成分

楊文聰，劉亞月，楊靜明，黎釗坪，梁金月，聶影影，馬小翔，張 翼

（1.廣東海洋大學深圳研究院，廣東 深圳 518120；2.廣東海洋大學食品科技學院// 廣東省水產品加工與安全重點實驗室// 廣東省海洋生物制品工程實驗室// 廣東省海洋食品工程技術研究中心// 水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室// 廣東海洋大學海洋藥物研究所，廣東 湛江 524088）

海洋真菌所產生的結構多樣的次級代謝物是藥物發現的重要來源之一[1-2]。它們通常具有抗腫瘤、抗HIV、抗真菌、抗細菌、抗AChE 和抗氧化等生物活性，作為藥物先導化合物日益受到研究者的關注[3-6]。然而，這些化合物只是真菌次生代謝潛力的“冰山一角”，為了充分挖掘菌株潛力，表觀遺傳修飾、等離子體誘變、基因組挖掘和共培養等各種方法被用于激活微生物天然產物沉默生物合成途徑[7-10]。表觀遺傳修飾方法主要通過抑制DNA 甲基轉移酶和組蛋白去乙?；?，因其具有較好的實用性，是一種越來越受重視的化學誘導手段[11-12]。

黑甲肉座菌Hypocrea lixii（哈茨木霉Trichoderma harzianum的有性型），為廣泛存在于植物的內生真菌，也是重要的生物防治用途的菌株。對該真菌的次級代謝產物的研究相對較少，值得深入研究[13]。本實驗室從大連海濱的海綿中分離得到一株真菌H.lixiiDLEN2008010，前期研究發現該菌株代謝產物具有DPPH 自由基清除活性及AChE抑制活性[14]。另外，文獻報導H.lixii這個種的菌株能產生異黃酮類化合物[15]，該類化合物通常顯示出較好的抗腫瘤、抗氧化和乙酰膽堿酯酶抑制活性[16-18]。然而，關于H.lixii次級代謝產物研究中未見使用表觀遺傳修飾誘導次級代謝產物多樣性的報道。為了深入挖掘H.lixiiDLEN2008010 的代謝潛力，并發現抗老年癡呆相關活性的代謝產物，本研究使用了一種DNA 甲基轉移酶抑制劑鹽酸普魯卡因刺激該真菌，分析其對菌株次級代謝的影響，從其固體發酵產物中分離異黃酮類化合物，并對其抗氧化和乙酰膽堿酯酶抑制活性進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與試劑 Advance 500 MHz 核磁共振波譜儀，maXis Q-TOF 高分辨質譜儀（德國Bruker公司）；1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Epoch2 酶標儀（美國BioTek 公司）；R-300 旋轉蒸發儀（瑞士 BüChi 公司）；HPX-9082MBE 電熱恒溫培養箱，BSC-1300ⅡA2生物安全柜（上海博訊實業有限公司）；IRM-100全自動高壓滅菌鍋（德國愛安姆公司）；HP Plus 50D超高壓液相色譜儀（蘇州利穗有限公司）；ME204E型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）。

電鰻乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE），C3389；碘代硫代乙酰膽堿（Acetylthiocholine iodide，ATCI），DA0048；牛血清蛋白（Bovine serum albumin，BSA），A1933；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH），D9132；海鹽，S9883 均購自Sigma-Aldrich；5,5’-二硫代二硝基苯甲酸（Dithiobisnitrobenzoic acid，DTNB），D8130，購自Ruibio 公司；鹽酸普魯卡因，購自上海阿拉丁試劑公司；瓊脂、蛋白胨均購自北京奧博星生物技術有限公司的生物純試劑；其余試劑均為國產分析純試劑；硅膠（0.15 mm～ 0.3 mm 和0.05 mm～ 0.075 mm）購自青島海洋化工廠；Sephadex LH-20，購自瑞士GE-Healthcare Bio-sciences公司；ODS-AP 反相制備色譜柱（20 mm×250 mm，15 μm，大連依利特公司）。

1.1.2 實驗菌株 海洋真菌Hypocrea lixiiDLEN2008010 分離自2008 年采集于中國遼寧省大連市付家莊海邊的海綿，經ITS rDNA 全序列分析確定為黑甲肉座菌（Genbank 登錄號：HQ149775），菌株保藏于廣東海洋大學海洋藥物研究所。

1.1.3 培養基配制 PDA 培養基：土豆汁500 mL（200 g 土豆熬至500 mL 土豆汁），蔗糖20 g，蛋白胨5 g，海鹽20 g，加入純水至1 L，121℃滅菌20 min（pH=7.2）。大豆培養基：往3 L 的錐形瓶加入500 g 大豆，500 mL 水，121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 規模培養、提取及分離 往30 個平放且含有大豆培養基的錐形瓶，各加入20 mL 生理鹽水洗落的菌懸液，置于28℃培養2 d，待有新的菌體形成后，均勻加入20 mL 過濾除菌的鹽酸普魯卡因水溶液，使其最終濃度為10 mmol/L，繼續培養30 d。規模培養結束后，重復三次往每個錐形瓶加入1 L甲醇，并超聲30 min，過濾，減壓濃縮濾液至3 L。

將上述粗提物用10 kg 的XAD-16 大孔樹脂吸附，并轉移至層析柱，通過加入純水將多糖除去，洗至流出液接近無色透明，后分別加入一個柱體積的甲醇、丙酮解吸附，真空濃縮至干，得粗提物1.2kg。

粗提物在減壓硅膠柱（0.15mm～ 0.3mm）依次經石油醚（Pe）/乙酸乙酯（EtOAc）（體積比為7∶3、1∶1、3∶7）、Pe、氯仿（Chl）/甲醇（MeOH）（體積比為10∶1、5∶1）和純甲醇洗脫得Fr.1～Fr.7。Fr.5（5 g）在硅膠柱（0.05mm～ 0.075mm）經Chl、Chl/ MeOH（體積比為 200∶1、100∶1、50∶1、40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1）各一個體積洗脫得到SFr.5-1～ SFr.5-10。SFr.5-4（0.25 g）經Sephadex LH-20 凝膠柱MeOH 洗脫得到組分SFr.5-4-1～ SFr.5-4-6。其中 SFr.5-4-4 經 pHPLC（ODS-AP，15 μm，20.0 mm × 250 mm）通過MeOH/H2O（體積比為1∶3）等度洗脫，在tR=16 min收集，得到化合物1（5 mg）。SFr.5-4-4 經pHPLC（色譜柱同上）通過MeOH/H2O（體積比為1∶3）等度洗脫，在tR=36 min收集得到化合物6（15 mg），在tR=48 min 收集得到化合物5（18 mg）。SFr.5-4-6經pHPLC（色譜柱同上）通過MeOH/H2O（體積比為2∶3）等度洗脫，在tR=17 min 收集得到化合物2（8 mg）。SFr.5-6（0.62 g）經Sephadex LH-20 凝膠柱MeOH 洗脫得到組分SFr.5-6-1～ SFr.5-6-6，從SFr.5-6-6 中使用硅膠制備薄層層析[展開劑為Chl/MeOH（體積比為10∶1）]得到化合物7（5 mg）。SFr.5-8（0.19 g）經pHPLC（色譜柱同上）通過MeOH/H2O（體積比為3∶7）等度洗脫，在tR=26 min 收集得到化合物4（5 mg）。Fr.4（4.3 g）在硅膠柱（0.05mm～0.075mm）經Pe/EtOAc（體積比為1∶1）洗脫至純乙酸乙酯，分別得到SFr.4-1～ SFr.4-9。其中SFr.4-4（0.73 g）經ODS 反相層析柱通過MeOH/H2O（體積比為2∶3）等度洗脫，得到化合物3（100 mg）。

1.2.2 HPLC 指紋圖譜分析 通過Agilent Infinity II 1260 分析在大豆培養基提取物及不同條件下Hypocrea lixii發酵提取物的HPLC 指紋圖譜。洗脫梯度如下：0～35 min，從體積分數為10%甲醇-H2O線性洗至100%甲醇；35～40 min，100%甲醇；40～42 min，純甲醇線性洗至體積分數為10%甲醇-H2O；42～ 45 min，體積分數為10%甲醇-H2O。進樣量10 μL，流速為1 mL/min，檢測波長為254 nm。

1.2.3 AChE 抑制活性測定 通過優化的Ellman 比色法[19]在96 孔板中測定化合物對AChE 體外抑制活性。將化合物溶解于DMSO 并配成10 mmol/L 且進行倍半梯度稀釋，往96 孔板中每孔加1 μL 不同濃度樣品，再依次加入49μL PBS、10μL 0.2 U/mL AChE 和20 μL DTNB，將96 孔板置于37℃培養箱保溫10 min。然后往每個孔加入20 μL ATCI，繼續于37℃培養箱孵育。20 min 后，通過酶標儀測定λ405處的吸光值，并通過下述公式計算化合物對AChE的抑制率，其中Asampleblank為加入樣品和BSA 而不加入AChE 的吸光度，Asample為加入樣品和AChE的吸光度，Acontrol為加入AChE 而不加入樣品的吸光度，Ablank為加入BSA 而不加入樣品和AChE 的吸光度。鹽酸化多奈哌齊作為陽性對照。

IC50值是化合物對AChE 抑制率為50%所對應的濃度。將抑制率和濃度對數（lnC）導入Origin 8.0軟件。通過三次多項式回歸方程擬合得到濃度對數曲線，并計算得到ln（IC50）。最后使用Microsoft Excel 計算得到IC50。

1.2.4 DPPH 自由基清除活性測定 使用Sharma和Bhat 描述的DPPH 自由基清除法[20]，在96 孔板中測定化合物的抗氧化能力?？偡磻w系為100μL，Asample為含有50μL 的0.16 mmol/L DPPH 和50μL溶解不同濃度化合物的DMSO。與此同時，50 μL 1.6 mmol/L DPPH 和50 μL DMSO 用作對照（Acontrol），50 μLMeOH 和50 μL 溶解不同濃度化合物的DMSO 作為樣品本底（Asampleblank），50 μLMeOH 和50 μL DMSO 作為空白（Ablank），將96 孔板放置在暗處30 min。通過酶標儀測定λ517處的吸光度。維生素C 作為陽性對照。

EC50值是化合物對DPPH 自由基清除率為50%所對應的濃度。將清除率和濃度對數（lnC）導入Origin 8.0 軟件。通過三次多項式回歸方程擬合得到濃度對數曲線，并計算得到ln（EC50）。最后使用Microsoft Excel 計算得到EC50。

2 結果與分析

2.1 結構鑒定

本研究從該菌株化學誘導發酵產物中共分離到以下7 種化合物（圖1）。

圖1 化合物1～7 的結構Fig.1 The structures of compounds 1～7

2.1.1 化合物1 化合物1 為淺黃色非晶型固體，在氯仿/甲醇（體積比為25∶1）的60 F254TLC 的Rf值為0.56，硫酸-茴香醛顯色為黃色。該化合物易溶于丙酮。HR-ESI-MS，m/z 計算值：499.1250（C25H23O11-，[M-H]-）；實測值：499.1240，確定分子式為C25H24O11，不飽和度為14；1H NMR 在δH3.45（1H，t，H-4’’），3.54（1H，m，H-2’’），3.59（1H，m，H-3’’），3.90（1H，m，H-5’’）和5.17（1H，d，J=7.5，H-1’’）提示分子中存在一個糖環的片段，在δH6.89（2H，dd，J=6.5，2.0 Hz，H-3’/5’）和7.44（2H，dd，J=7.0，2.0 Hz，H-2’/6’）提示分子中存在一個對位取代的苯環。核磁波譜數據如下。

1H NMR（500 MHz，Acetone-d6）：δH1.87（3H，dd，J=6.9，1.7 Hz，H-4’’’），3.45（1H，t，H-4’’），3.54（1H，m，H-2’’），3.59（1H，m，H-3’’），3.90（1H，m，H-5’’），4.22（1H，dd，J=11.9，7.4 Hz，Ha-6’’），4.54（1H，dd，J=12.0，2.1 Hz，Hb-6’’），5.17（1H，d，J=7.5，H-1’’），5.90（1H，dd，J=15.6，1.7 Hz，H-2’’’），6.47（1H，d，J=2.2 Hz，H-6），6.66（1H，d，J=2.2 Hz，H-8），6.89（2H，dd，J=8.7，2.0 Hz，H-3’/5’），6.97（1H，dq，J=15.5，6.7 Hz，H-3’’’），7.44（2H，dd，J=8.7，2.0 Hz，H-2’/6’），8.24（1H，s，H-2），8.60（1H，brs，4’-OH），13.00（1H，s，5-OH）。

13C NMR（125 MHz，Acetone-d6）：δC18.1（C-4’’’），64.1（C-6’’），71.3（C-4’’），74.5（C-2’’），75.2（C-5’’），77.8（C-3’’），95.5（C-8），100.6（C-6），101.2（C-1’’），107.6（C-10），116.0（C-3’/5’），122.8（C-3），123.2（C-2’’’），124.3（C-1’），131.2（C-2’/6’），145.8（C-3’’’），154.8（C-2），158.6（C-4’），163.5（C-5），164.3（C-7），166.4（C-1’’’），181.9（C-4）。

分析1H NMR、13C NMR，且通過J1’’2’’＞7.0 Hz確定葡萄糖殘基的β 構型，通過J2’’’3’’’＞15.0 Hz 確定側鏈雙鍵的反式構型，并與文獻[21]比對，確定該化合物為6''-O-crotonylgenistin。

2.1.2 化合物2 化合物2 為白色非晶型固體，在氯仿/甲醇（體積比為10∶1）的60 F254TLC 的Rf值為0.51，硫酸-茴香醛顯色為黃色。該化合物易溶于丙酮。1H NMR 在δH6.90（2H，d，J=8.6 Hz，H-3’/5’）和7.45（2H，d，J=8.6 Hz，H-2’/6’）提示分子中存在一個對位取代的苯環。核磁波譜數據如下。

1H NMR（500 MHz，Acetone-d6）：δH6.28（1H，d，J=2.1 Hz，H-6），6.42（1H，d，J=2.1 Hz，H-8），6.90（2H，d，J=8.6 Hz，H-3’/5’），7.45（2H，d，J=8.6 Hz，H-2’/6’），8.15（1H，s，H-2），9.00（1H，brs，4’-OH），13.02（1H，s，5-OH）。

13C NMR（125 MHz，Acetone-d6）：δC94.5（C-8），99.9（C-6），106.1（C-10），116.0（C-3’/5’），123.1（C-1’），124.0（C-3），131.2（C-2’/6’），154.3（C-2），158.4（C-4’），159.1（C-9），163.9（C-5），165.3（C-7），181.6（C-4）。

分析1H NMR、13C NMR 并與文獻[22]比對，確定該化合物為genistein。

2.1.3 化合物3 化合物3 為淺黃色非晶型固體，在氯仿/甲醇（體積比為10∶1）的60 F254TLC 的Rf值為0.50，硫酸-茴香醛顯色為淺紫色。該化合物易溶于DMSO。1H NMR 在δH6.80（1H，d，J=8.7 Hz，H-3’/5’）和7.37（2H，d，J=8.7 Hz，H-2’/6’）提示分子中存在一個對位取代的苯環。核磁波譜數據如下。

1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δH6.81（1H，d，J=2.3 Hz，H-8），6.80（2H，d，J=8.7 Hz，H-3’/5’），6.90（1H，dd，J=8.8，2.3 Hz，H-6），7.37（2H，d，J=8.7 Hz，H-2’/6’），7.94（1H，d，J=8.7 Hz，H-5），8.26（1H，s，H-2），9.60（1H，brs，4’-OH）。

13C NMR（125 MHz，DMSO-d6）：δC102.0（C-8），114.9（C-3’/5’），115.5（C-6），116.2（C-10），122.6（C-3），123.4（C-1’），127.2（C-5），130.1（C-2’/6’），152.7（C-2），157.1（C-4’），157.5（C-9），163.4（C-7），174.6（C-4）。

分析1H NMR、13C NMR 并與文獻[23]比對，確定化合物為daidzein。

2.1.4 化合物4 化合物4 為淺黃色非晶型固體，在氯仿/甲醇（體積比為10∶1）的60 F254TLC 的Rf值為0.1，硫酸-茴香醛顯色為無色。該化合物易溶于DMSO。1H NMR 在δH3.17（1H，t，J=9.0 Hz，H-4’’）、3.26（1H，m，H-2’’）、3.31（1H，m，H-3’’）、3.45（2H，m，H-5’’，H-6’’b）、3.71（1H，d，J=7.6 Hz，H-6’’a）和5.06（1H，d，J=7.6 Hz，H-1’’）提示分子中存在一個糖環的片段，δH6.83（2H，dd，J=8.6，1.4 Hz，H-3’/5’）和7.40（2H，dd，J=8.6，1.4 Hz，H-2’/6’）提示分子中存在一個對位取代的苯環。核磁波譜數據如下。

1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δH3.17（1H，t，J=9.0 Hz，H-4’’），3.26（1H，m，H-2’’），3.31（1H，m，H-3’’），3.45（2H，m，H-5’’，H-6’’b），3.71（1H，d，J=7.6 Hz，H-6’’a），5.06（1H，d，J=7.6 Hz，H-1’’），6.47（1H，d，J=2.2，H-6），6.72（1H，d，J=2.2 Hz，H-8），6.83（2H，dd，J=8.6，1.4 Hz，H-3’/5’），7.40（2H，dd，J=8.6，1.4 Hz，H-2’/6’），8.43（1H，s，H-2），9.74（1H，brs，7-OH），12.94（1H，brs，5-OH）。

13C NMR（125 MHz，DMSO-d6）：δC60.6（C-6’’），69.6（C-4’’），73.1（C-2’’），76.4（C-3’’），77.2（C-5’’），94.5（C-8），99.6（C-6），99.9（C-1’’），106.1（C-10），115.1（C-3’,C-5’），121.0（C-1’），122.6（C-3），130.2（C-2’,C-6’），154.6（C-2），157.2（C-9），157.6（C-4’），161.6（C-5），163.0（C-7），180.5（C-4）。

分析1H NMR、13C NMR，且通過J1’’2’’＞7.0 Hz確定葡萄糖殘基的β 構型，并與文獻[24]比對，確定該化合物為genistin。

2.1.5 化合物5 化合物5 為黃色非晶型固體，在氯仿/甲醇（體積比為10∶1）的60 F254TLC 的Rf值為0.87，硫酸-茴香醛顯色為檸檬黃。該化合物易溶于甲醇、丙酮。核磁波譜數據如下。

1H NMR（500 MHz，acetone-d6）：δH3.77（3H，s，H3-8），5.40（2H，brs，4-NH2），6.67（2H，dd，J=6.3，1.4 Hz，H-3/5），7.72（2H，dd，J=6.3，1.4 Hz，H-2/6）。

13C NMR（125 MHz，acetone-d6）：δC51.4（C-8），113.9（C-3,C-5），118.5（C-1），132.1（C-2,C-6），154.0（C-4），167.3（C-7）。

分析1H NMR、13C NMR 并與文獻[25]比對，確定該化合物為對氨基苯甲酸甲酯。

2.1.6 化合物6 化合物6 為淺黃色針狀結晶，在甲醇/水（體積比為2∶3）的C18TLC 的Rf值為0.43，硫酸-茴香醛顯色為粉色。該化合物易溶于甲醇。核磁波譜數據如下。

1H NMR（500 MHz，CD3OD）：δH2.53（2H，t，J=7.7 Hz，H2-8），2.80（2H，t，J=7.7 Hz，H2-7），6.69（2H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-3/5），7.03（2H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-2/6）。

13C NMR（125 MHz，CD3OD）：δC31.2（C-7），37.2（C-8），116.2（C-3,C-5），133.0（C-1），130.2（C-2,C-6），156.7（C-4），177.0（C-9）。

分析NMR 數據并與文獻[26]比對，確定化合物為對羥基苯丙酸。

2.1.7 化合物7 化合物7 為淺黃色針狀結晶，在甲醇/水（體積比為4∶1）的C18TLC 的Rf值為0.8，硫酸-茴香醛顯色無色。該化合物易溶于DMSO。核磁波譜數據如下。

1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δH5.44（1H，d，J=7.6 Hz，H-5），7.37（1H，d，J=7.6 Hz，H-6），10.94（2H，brs，1-NH/3-NH）。

13C NMR（125 MHz，DMSO-d6）：δC100.2（C-5），142.3（C-6），151.6（C-2），164.3（C-4）。

分析NMR 數據并與文獻[27]比對，確定該化合物為尿嘧啶。

2.2 HPLC 指紋圖譜

為了考察鹽酸普魯卡因對海洋真菌黑甲肉座菌Hypocrea lixii次生代謝產物的影響及化合物來源，對大豆培養基提取物及H.lixii在不同條件下（添加或未添加鹽酸普魯卡因的大豆培養基）發酵提取物的指紋圖譜做了對比。

結果如圖2 所示，在大豆培養基提取物及正常大豆培養基中菌株的發酵提取物（圖2-A和圖2-B）中均未能檢測到化合物1，而在添加了鹽酸普魯卡因的Soy 培養基中該原始菌株的代謝物（圖2-C）能夠產生化合物1?；衔?～4 在大豆培養基提取物指紋圖譜（圖2-A）中也觀察到了保留時間相近、紫外吸收特征相同的峰。

化合物5 僅存在于添加了誘導劑鹽酸普魯卡因的發酵提取物中，而化合物6 在有無添加誘導劑的發酵產物中都存在，而未見于大豆培養基提取物中（相同保留時間處雖有色譜峰，但紫外光譜有差異），化合物7 也主要存在于兩種發酵產物中，在大豆培養基中未見明顯色譜峰。

另外，加了鹽酸普魯卡因誘導的菌株能產生一些僅在大豆培養基中發酵所不能產生的代謝物（如保留時間4.9 min、6 min、20 min、28.5 min 處的峰），同時還能刺激H.lixii提高某些在大豆培養基中發酵代謝產物的產量（如保留時間1.0～2.5 min 及8 min 處的峰），這些代謝產物的結構還有待進一步研究。

圖2 254 nm 下大豆培養基及Hypocrea lixii DLEN2008010 不同培養條件發酵提取物的HPLC 指紋圖譜.Fig.2 The 254 nm detected HPLC fingerprints for soybean cultural medium and Hypocrea lixii DLEN2008010 fermentation extracts under different cultural conditions.

2.3 抗氧化活性

采用Sharma 和Bhat 描述的DPPH 自由基清除法對化合物1～6 進行抗氧化活性評價，化合物7 因為考慮到只是普通的堿基，故未測活性。結果顯示，化合物1～4 在100 μmol/L 劑量濃度下顯示了較弱的DPPH 自由基清除活性（表1）。

表1 化合物1～ 4 的DPPH 自由基清除活性Table 1 The DPPH free radical scavenging activities of compounds 1– 4

2.4 乙酰膽堿酯酶抑制活性

采用改良的Ellman比色法對化合物1～6進行抗乙酰膽堿酯酶活性評價。結果顯示，在100 μmol/L劑量濃度下化合物1～4 活性較微弱，而化合物5 和6 活性相對較明顯（表2）。

表2 化合物1～ 4 的AChE 抑制活性Table 2 The inhibitory activities for AChE of compounds 1– 4

3 討論

本實驗中，化合物1 僅在添加了化學誘導劑的發酵產物中被檢測到，推測是在誘導劑的刺激下，菌株相關代謝基因被激活，從而利用大豆中的異黃酮代謝產生了化合物1。該化合物首次被發現是從紅曲霉發酵黑豆中分離得到的[21]，本文為其第二次報道，也是首次從Hypocrea lixii發酵大豆中分離得到?；衔?～4 則普遍存在于大豆中[28]，在大豆培養基提取物指紋圖譜中也存在，因此推測它們源自培養基。

從結構相關性上推測，化合物5 與鹽酸普魯卡因均含有對氨基苯甲酸片段，推測該化合物為鹽酸普魯卡因被真菌代謝所產生，這也是該化合物生物轉化來源的首次報道。

化合物6 在有無添加誘導劑的發酵產物中都存在，而在大豆培養基提取物中未檢測到，而且該化合物曾從海洋細菌、多黏類芽孢桿菌、陸生真菌等微生物以及小葉榕等來源分離得到（而未見于大豆中報道）[26,29-31]，因此我們推測它為H.lixii的代謝產物，本研究為首次從真菌Hypocrea lixii中分離得到?；衔? 則為生命基礎代謝成分，推測真菌發酵使得大豆的核酸類成分降解從而提高了其含量。

表觀遺傳修飾是一種運用較方便的化學誘導手段，其主要作用機制是通過抑制DNA 甲基轉移酶酶或組蛋白去乙?；?，從而使染色體的結構局部松散化，利于DNA 與轉錄因子的結合，從而促進沉默基因的表達和相應次級代謝產物的產生[32]。在利用該手段對真菌進行化學表觀遺傳修飾時，菌株對誘導劑種類及其劑量的敏感性非常重要，普魯卡因是一種DNA 甲基轉移酶抑制劑，De Feliciode等發現普魯卡因與丙戊酸共同作用可促進炭角菌代謝[33]，在本研究之前對一株海洋爪曲霉的研究中，發現普魯卡因與NaBr 可協同誘導菌株產生2 種縮酚酸環醚類化合物[34]。本實驗中也發現普魯卡因導致H.lixii可產生僅此條件下出現的化合物1 及一些尚待鑒定的化合物，并提高一些代謝產物的產量。上述表明該表觀遺傳修飾劑有較廣泛的作用對象。

在活性篩選中，化合物1～6 顯示了較弱的抗氧化及乙酰膽堿酯酶抑制活性，其中化合物5 和6 的乙酰膽堿酯酶抑制活性相對較強（未見前人報道），考慮到化合物1 的2 個類似物曾從黃芪中分離得到并被報道具有抗炎活性[35]，化合物5 及其衍生物曾被報道具有促進間充質干細胞分化為成骨細胞的促骨再生作用[36]，化合物6 曾被報道具有抗炎活性[31]，這些化合物的活性還有待進一步擴大篩選研究以挖掘其應用價值。該菌株提取物中的其他成分也有待繼續進行深入分離鑒定及活性研究。

4 結論

本研究對一株海洋真菌Hypocrea lixiiDLEN2008010 采用鹽酸普魯卡因進行化學誘導，從中分離鑒定了7 個化合物，并研究了其抗氧化及乙酰膽堿酯酶抑制活性。其中化合物1 是從Hypocrea lixii分離得到的首個具有丁烯酰側鏈的染料木素糖苷，化合物6 也為首次該菌中分離得到，豐富了該菌的次級代謝產物多樣性?；衔? 為生物轉化來源的首例報道?；衔? 和6 表現了一定程度的乙酰膽堿酯酶抑制活性，為首次報道。鹽酸普魯卡因對該菌的次生代謝有顯著影響，該菌株的化學成分研究工作還在繼續深入進行之中，有待后續報道。