CD200R在肺鱗狀細胞癌組織中的表達及其臨床意義*

孫倩 李舒展 魏楓 任秀寶

肺鱗狀細胞癌（lung squamous cell carcinoma，LSCC）是世界范圍內常見的惡性腫瘤之一，占所有肺癌病例的30%，每年導致全世界約400 000例患者死亡［1］。LSCC 的特點是治療反應差，預后差，復發率高，且目前仍缺乏分子靶向治療［2］。因此，鑒定可能表明預后不良并揭示潛在相關機制的關鍵分子標志物對于尋找新的LSCC 治療靶點至關重要。免疫檢查點在維持免疫耐受中具有重要作用，可防止免疫細胞過度活化，避免發生慢性炎癥和自身免疫［3］。作為免疫檢查點之一，白細胞分化抗原CD200 及其受體（CD200 receptor，CD200R）均是跨膜糖蛋白，其相互作用調節髓樣細胞活化和Th1/Th2 細胞因子產生來介導腫瘤免疫反應，移植排斥以及自身免疫和炎癥反應中的T 細胞刺激［4］。CD200R 是免疫球蛋白（Ig）超家族的成員，最初主要在髓系細胞中被發現，研究表明CD200R 也可在粒細胞、T 細胞和肥大細胞上表達［5］。雖然在腫瘤中有關CD200R 表達尚有報道，但在LSCC 中CD200R 表達研究鮮有報道。本研究旨在通過對LSCC 患者的CD200R 表達進行檢測，分析其與患者的臨床參數以及生存時間等相關性，同時敲低鱗癌細胞系中CD200R 表達并檢測其對細胞生長增殖和克隆形成能力的影響，探討其是否可作為預測患者預后新的標志物，為腫瘤免疫治療提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例資料 收集2004年1月至2011年12月100例于天津醫科大學腫瘤醫院接受治療的LSCC患者的組織標本，所有患者手術前均未行化療或放療，并根據國際癌癥控制聯盟（UICC）/TNM（第7版）進行分類，其中Ⅰ期39例、Ⅱ期29例、Ⅲ期25例、Ⅳ期7例?；颊咧形簧鏁r間為64個月，隨訪期為0～120個月。本研究獲得天津醫科大學腫瘤醫院倫理委員會批準且患者知情同意。

1.1.2 組織芯片 所有LSCC 患者的樣本通過H&E染色進行組織學評價。組織芯片由上海超越生物技術有限公司制造。

1.1.3 試劑 CD200R抗體購自美國Abcam公司，二抗購自福建邁新公司，DAB顯色試劑盒購自北京中杉金僑生物技術有限公司，actin抗體購自美國Cell Signaling公司，CCK8試劑盒購自美國Life Technologies公司。

1.1.4 細胞系 肺鱗癌細胞系NCI-H520 細胞由本實驗室培養和傳代，培養基為RPMI 1640和10%胎牛血清。

1.1.5 CD200R siRNA 序列合成 為驗證CD200R 在腫瘤細胞中表達的意義，合成針對CD200R的小干擾RNA，序列為5'-GCAAGGAGAATCATGCTTTAG-3'，由上海吉瑪制藥技術有限公司設計并合成，合成后按照說明書經Lipo3000試劑進行轉染，48 h后收集細胞行相應實驗。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學法 將石蠟切片依次經過脫蠟，抗原修復，清洗，封閉后，將一抗抗體以1：50比例進行4℃冰箱過夜孵育，PBS清洗3次后，室溫進行二抗孵育，30 min 之后使用DAB 顯色，蘇木素溶液復染，脫水透明后封片，重復晾干后進行分析。所有染色結果均由兩位病理科醫師單獨評估判定，細胞質及細胞膜呈褐色染色的腫瘤細胞視為陽性。強度的評分標準為：陰性為0、弱陽性為1分、陽性為2分、強陽性為3 分，陽性腫瘤細胞百分比評分標準為：1 為1%～50%、2 為51%～75%、3 為≥76%，將每個樣本的得分相乘得到最終評分。評分≥6 分定義為高表達，評分＜6分定義為低表達。

1.2.2 免疫印跡方法 SDS 裂解液裂解細胞后將樣品煮沸10 min，取上清用于免疫印跡檢測。轉膜后封閉1 h，之后加入一抗4℃過夜后PBS 洗3 次，二抗室溫孵育1 h后曝光。

1.2.3 CCK8方法 在96孔板中接種細胞懸液1×103/100μL，培養不同時間點后取出孔板，加入CCK8 溶液10 μL/孔，孵箱內繼續孵育1～4 h 后檢測細胞增殖，使用酶標儀測定450 nm吸光度OD值用以繪制細胞增殖曲線。

1.2.4 克隆形成能力檢測 收集單細胞懸液將100～200個細胞接種在100 mm培養板中，持續培養14天以觀察克隆生長情況。當細胞克隆清晰可見時，停止培養，多聚甲醛固定后，使用結晶紫染色并通過軟件進行計數。

1.3 統計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。χ2檢驗用于確定CD200R表達與臨床病理參數之間的相關性，使用Kaplan-Meier 法評估總體生存（overall survival，OS）期和無病生存（disease free survival，DFS）期，利用Cox 風險回歸模型進行多因素分析。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 LSCC組織中CD200R的表達情況

CD200R主要在胞漿和細胞膜著色表達（圖1）。55%（55/100）患者的癌組織中CD200R高表達，45%（45/100）為低表達。CD200R表達水平在與患者的臨床病理特征之間的關系，包括年齡、性別、吸煙狀況、T分期、淋巴結轉移、遠處轉移和臨床分期方面，CD200R高表達和低表達之間無顯著性相關（P＞0.05，表1）。

圖1 免疫組織化學法檢測LSCC患者組織中CD200R的表達（SP×200）

2.2 LSCC組織中CD200R表達水平與患者預后的關系

100例LSCC患者組織中CD200R表達與預后之間關系表明，CD200R高表達患者的中位總生存（median OS，mOS）期和DFS期為46個月和32個月，而低表達患者未達到mOS和中位DFS（median DFS，mDFS）。Kaplan-Meier生存分析進一步表明CD200R高表達與預后不良有關，在LSCC中CD200R高表達患者的OS和DFS更短（P=0.020，P=0.001，圖2）。

表1 LSCC患者組織中的CD200R表達與臨床病理特征的關系

圖2 LSCC組織中CD200R表達水平與患者預后的關系

2.3 單因素和Cox風險回歸模型多因素分析

單因素分析結果顯示，T分期、淋巴結轉移、遠處轉移和CD200R 表達與OS 有顯著性相關；淋巴結轉移、遠處轉移和CD200R 表達與DFS 有顯著性相關。將上述單因素變量納入Cox 風險回歸模型多因素分析，結果表明淋巴結轉移，遠處轉移和CD200R 表達是較短的OS 和DFS 的獨立危險因素（表2、3，P＜0.05）。CD200R表達可作為預測較差OS和DFS的獨立影響因素。

表2 影響OS率的單因素和多因素分析

表3 影響DFS率的單因素和多因素分析

2.4 肺鱗癌細胞系中敲低CD200R 表達對細胞生長和克隆形成能力的影響

免疫印跡法結果顯示，敲低CD200R后其蛋白表達下調（圖3），CCK8細胞增殖實驗結果顯示CD200R表達下降后細胞的增殖速度減緩（圖4，P＜0.05），克隆形成實驗結果顯示敲低CD200R 后克隆數明顯減少（圖5，P＜0.01），表明CD200R在細胞的生長增殖中發揮一定作用。

圖3 免疫印跡法檢測NCI-H520細胞中敲低CD200R后蛋白表達情況

圖4 CCK8實驗檢測敲低NCI-H520細胞中CD200R后細胞的增殖情況

圖5 克隆形成實驗檢測NCI-H520細胞中敲低CD200R后對細胞克隆數的影響

3 討論

近年來，免疫療法已成為繼手術及放化療后的第四位癌癥治療方法，在多種腫瘤中顯示出較好療效。免疫檢查點可防止免疫細胞的過度激活，控制淋巴細胞增生、慢性炎癥和自身免疫等反應。抑制免疫檢查點途徑已成為新型腫瘤治療方法并受到廣泛關注［6］，抗PD-1和CTLA-4的抗體已被批準用于治療部分腫瘤并取得了良好效果［7-8］，而其他的免疫檢查點仍缺乏相關研究。

CD200R 已知的唯一配體為CD200，二者之間的相互作用在免疫抑制和調節中非常重要。CD200 在大量細胞上表達，如胸腺細胞、活化T 細胞、B 細胞、樹突狀細胞（DC）、血管內皮細胞和毛囊細胞等。而CD200R的表達范圍則相對比較局限，關于該免疫檢查點通路的研究，大部分是集中在炎癥和免疫性疾病等方面，在腫瘤中并不多見。關于CD200 在腫瘤中的表達有部分報道，如在胰腺癌、膀胱癌、結腸癌和卵巢癌中呈高表達［9-10］，且CD200也是多發性骨髓瘤和急性髓性白血病的獨立預后因素，對患者的OS率降低可進行預測。然而，CD200R在腫瘤中的表達情況鮮有報道。Sun 等［11］研究發現，CD200R 可在肝細胞肝癌高表達，且和患者的預后相關。也有研究報道，CD200 和CD200R 在腎臟和膀胱腫瘤中有一定表達，但尚未分析其與臨床病理參數和預后的關系［12］。

本研究采用免疫組織化學法檢測LSCC 組織中CD200R的表達發現，55%（55/100）癌組織中CD200R呈高表達，45%（45/100）呈低表達。CD200R 表達水平與年齡、性別、吸煙狀況、T分期、淋巴結轉移、遠處轉移和臨床分期等無顯著性相關。此外，CD200R高表達患者的OS 和DFS 均明顯低于CD200R 低表達者，單因素及多因素分析結果表明，CD200R 可作為預測生存的獨立危險因素。

目前，CD200R 在腫瘤中的作用機制僅有部分報道。Pilch［13］等研究發現激動性抗CD200R 抗體的應用可改善TLR7信號通路介導的抗腫瘤作用，并改變局部腫瘤微環境，降低腫瘤相關巨噬細胞標志物表達和細胞因子IL-1β 的產生能力，減緩腫瘤進展。Liu［14］等研究發現CD200R 缺陷型小鼠接受CD200 陽性B16 黑色素瘤細胞靜脈注射后在多個器官表現出大量腫瘤生長，而在野生型小鼠中相同腫瘤的生長受到限制，即CD200R缺陷小鼠中腫瘤微環境發生改變，靶向CD200R信號轉導可能干擾腫瘤的轉移和生長。Mihrshahi［15］等研究發現酪氨酸激酶2（Dok2）及其下游蛋白RAS p21 蛋白激活劑1（RasGAP）在人和小鼠髓系細胞CD200R 信號轉導中發揮重要作用，shRNA 敲低Dok2 和RasGAP 后CD200R 介導的細胞激活被抑制。本研究在NCI-H520 細胞中敲低CD200R 表達后，細胞的增殖降低，證實其可能在腫瘤生長中發揮一定作用。關于CD200R在腫瘤細胞和其他免疫細胞中的信號調節機制仍需進一步研究。

綜上所述，本研究發現在LSCC 組織中CD200R高表達，且與患者的不良預后相關，敲低CD200R 后細胞生長增殖能力和克隆形成能力下降。因此，CD200R可作為一種新的腫瘤標志物，用于臨床上評估患者預后。而CD200R 很有可能是影響腫瘤發生發展的重要免疫檢查點之一，對其作用及調節機制的深入研究將為腫瘤治療提供新的思路。