壯藥龍鉆通痹方對膠原誘導型關節炎大鼠Th22/IL-22調控機制研究

張青槐　龐宇舟　藍毓營　韋露秋　陳秋霞　田照　高慧

【摘 要】 目的：探究壯藥龍鉆通痹方對膠原誘導型關節炎大鼠（CIA）血清Th22的作用機制。方法：通過牛Ⅱ膠原蛋白與弗氏不完全佐劑混合液誘導類風濕關節炎樣的大鼠模型，60只雄性Wistar大鼠隨機分為正常組，模型組、甲氨蝶呤組（MTX組），壯藥龍鉆通痹方（簡稱壯方）低劑量組1.35g/（kg·d），壯方中劑量組2.7g/（kg·d），壯方高劑量組5.4g/（kg·d），每組各10只。以足跖容積檢測儀檢測足跖容積變化情況， 流式細胞儀檢測和酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測Th22、IL-22表達水平，HE染色觀察滑膜形態學變化。結果：壯藥龍鉆通痹方高劑量組顯著減小膠原誘導型關節炎模型大鼠的足跖容積（P﹤0.05），降低踝關節炎癥細胞浸潤，下調Th22蛋白與其效應因子IL-22的表達水平（P﹤0.05）。結論：壯藥龍鉆通痹方對膠原誘導型關節炎大鼠具有較好的治療作用，其作用機制可能與抑制Th22蛋白與其效應因子IL-22的表達有關。

【關鍵詞】 類風濕關節炎;壯藥龍鉆通痹方;Th22;IL-22

【中圖分類號】R285.5 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2020）23-0011-04

Study on the Regulation Mechanism of Zhuang Yao Long Zuan Tong Bi Recipe on Th22/IL-22 in Collagen-induced Arthritis Rats

ZHANG Qinghuai PANG Yuzhou LAN Yuying WEI Luqiu CHEN Qiuxia TIAN Zhao GAO Hui*

Guangxi University of TCM，Nanning 530001，China

Abstract：Objective To explore the mechanism of Zhuang Yao Long Zuan Tong Bi Fang on serum Th22 in collagen-induced arthritis rats （CIA）. Methods A rheumatoid arthritis-like rat model was induced by a mixture of bovine Ⅱ collagen and Freunds incomplete adjuvant. Sixty male Wistar rats were randomly divided into a normal group， a model group， and a methotrexate group （MTX group） ）， Zhuang medicine Long Zuan Tong Bi Fang （referred to as Zhuang Fang） low-dose group 1.35g/（kg·d）， Zhuang Fang middle-dose group 2.7g/（kg·d）， Zhuang Fang high-dose group 5.4g/（kg·d）， 10 animals in each group. The foot and plantar volume detector was used to detect the changes of foot and plantar volume. Flow cytometry and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） were used to detect the expression levels of Th22 and IL-22. HE staining was used to observe the changes of synovial morphology.Results The high-dose group of Zhuang Yao Long Zuan Tong Bi Fang significantly reduced the plantar volume of collagen-induced arthritis model rats （P﹤0.05）， reduced the infiltration of inflammatory cells of the ankle joint， and down-regulated the Th22 protein and its effector IL-22 Expression level （P﹤0.05）. Conclusion Zhuang Yao Long Zuan Tong Bi Recipe has a good therapeutic effect on collagen-induced arthritis rats， and its mechanism may be related to the inhibition of the expression of Th22 protein and its effector IL-22.

Keywords：Rheumatoid Arthritis; Zhuang Medicine Long Zuan Tong Bi Fang; Th22; IL-22

類風濕關節炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種以對稱性關節滑膜病理改變和慢性炎癥為主要特征的自身免疫性疾病，臨床表現為關節晨僵、腫脹、疼痛、嚴重者表現為關節畸形，其發病率在我國約為0.32%～0.36%，已成為人群致殘的主要疾病之一[1-2]。課題組前期研究表明[3-5]，壯藥龍鉆通痹方可提高 IL-4、IL-10 的水平，能下調關節炎大鼠血清 IFN-γ、TNF-α、MMP-13 水平，提示這可能是其治療類風濕關節炎的作用機理之一。近年來研究發現，CD4+T細胞亞群失衡與RA的發生發展有密切聯系，CD4+T 細胞功能亞群中的Th22細胞及其分泌的白細胞介素-22（IL-22）是類風濕關節炎疾病反應的重要環節[6]，Th22細胞水平與其效應因子IL-22在RA患者的滑膜組織表達水平中有上調作用[7]。本病屬于壯醫“發旺”范疇，壯藥龍鉆通痹方是廣西中醫藥大學龐宇舟教授治療活動期類風濕關節炎的經驗方，該方能明顯降低RA患者的血沉，臨床治療有效率可達85.0%[8]，為進一步的臨床應用提供客觀實驗依據。筆者通過分析膠原誘導型關節炎模型大鼠血清Th22和LI-22的表達水平，探討壯藥龍鉆通痹方對類風濕關節炎的調控機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物與分組 SPF級雄性Wistar大鼠60只，體重約170～230g，由廣西醫科大學動物實驗中心提供。飼養于本單位SPF級動物實驗房，溫度20～25℃，濕度40%～60%，適應性喂養一周后隨機分為正常組、模型組、甲氨蝶呤組（MTX組），壯藥龍鉆通痹方（簡稱壯方）低劑量組、壯方中劑量組、壯方高劑量組，每組10只。

1.2 藥物與試劑 壯藥龍鉆通痹方由主藥飛龍掌血、大鉆，幫藥八角楓、兩面針、青風藤、九龍藤、五指毛桃、雞血藤等組成，壯醫龍鉆通痹顆粒由廣西中醫藥大學附屬百年樂制藥廠生產（批號：20180508）;甲氨蝶呤片由通化茂祥制藥有限公司生產（MTX，2.5mg/片，生產批號：國藥準字H2202267）;牛Ⅱ膠原蛋白、弗氏不完全佐劑（IFA）購自Sigma公司，流式抗體（CD4和IL-22）（美國Invitrogen公司），IL-22 ELISA 試劑盒（R&D公司）。

1.3 主要儀器設備 多功能酶標儀（瑞士TEACAN ，M200） ;足跖容積檢測儀（成都泰盟，PV-200）;高冷凍離心機（德國 Sigma，3K15）;倒置顯微鏡（德國萊卡，DM18） 等。

2 實驗方法

2.1 動物模型制備 除正常組外，其余50只按照參考文獻[9]所述方法造成CIA大鼠模型，即牛Ⅱ型膠原溶于0.1mol/L的冰醋酸，最終濃度為 2mg/mL后放置在4℃冰箱中過夜，次日將其與等量的弗氏不完全佐劑完全乳化。在大鼠左后跖底部注射乳劑0.2mL/只，7d后再次免疫，即尾根部注射乳劑0.2mL，進而誘發類風濕關節炎大鼠模型。大鼠足爪紅腫，足墊增厚，行動遲緩，踝關節炎癥細胞浸潤，病理切片提示滑膜增厚，表示造模成功。模型制備成功后第7天開始給藥，模型組予生理鹽水2mL/100g灌胃，每天1次;陽性對照組灌服甲氨蝶呤藥液2.7mg/kg（成人臨床用藥的3倍），每只灌服約0.405mg，每周灌服1次;壯藥龍鉆通痹方成人標準用量為30g/d，龍鉆通痹方高、中、低劑量組分別以龍鉆通痹方（含生藥16、8、4g/kg）2mL/100g，每日分2次灌胃。正常對照組自由飲水，6組大鼠共喂養21d。

2.2 足跖容積測量 使用足跖容積檢測儀測量各組大鼠的足跖容積，測量前在大鼠踝關節做標記，以確保測量的準確性，在灌胃后的第7天、第14天、第21天的下午3點進行測量，動態觀察大鼠足跖容積變化情況。

2.3 流式細胞儀檢測血清Th22水平、ELISA法檢測血清IL-22表達水平 采集大鼠血清2mL，通過靜置離心后得到血清樣本，各步驟按照產品說明書進行，采用流式細胞儀檢測血清Th22表達水平;ELISA法檢測血清IL-22表達水平。

2.4 HE 染色法觀察踝關節滑膜病理增厚程度 踝關節組織放入4%的多聚甲醛溶液中固定24h后轉移至脫鈣中，經過包埋、切片、烘干、 脫蠟、HE染色等步驟后，于光鏡下觀察各組大鼠踝關節滑膜病理切片情況。

2.5 統計學方法 研究數據運用SPSS 19.0 統計軟件處理，計量資料以均數加減標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗和校正t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠足跖容積變化情況比較 與正常組相比，模型組大鼠的足跖容積明顯大于正常組，在第14天、第21天差異有統計學意義（P<0.05），表明造模成功;與模型組相比，壯方高劑量組與甲氨蝶呤組足跖容積減?。≒<0.05），說明壯藥龍鉆通痹方能夠緩解類風濕關節炎CIA大鼠關節腫脹程度;結果見表1。

3.2 各組大鼠血清中Th22、IL-22表達水平比較 與正常組相比，Th22細胞在RA大鼠全血中表達顯著高于正常大鼠，模型組大鼠血清中IL-22顯著升高;與模型組相比，甲氨蝶呤組和壯藥龍鉆通痹方不同劑量組干預后血清中IL-22水平均有降低，但甲氨蝶呤組和壯方高劑量組降低更顯著，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。結果見表2。

3.3各組大鼠踝關節滑膜病理形態比較 HE染色結果顯示，正常組大鼠踝關節滑膜無炎癥細胞浸潤，滑膜表面光滑;模型組滑膜細胞增殖明顯，充滿炎性物質，層次不清;與模型組相比，壯藥龍鉆通痹方高劑量劑量組效果明顯，炎癥細胞較少，表面光滑，滑膜增生得到一定緩解，中劑量組次之，低劑量組與模型組無顯著性差異。甲氨蝶呤組和壯方高劑量組效果更好，如圖1所示。

4 討論

類風濕關節炎是一種由遺傳、感染、內分泌、免疫等多種因素引起的自身免疫性疾病，現代醫學治療多以改善病情的抗風濕藥（DMARDs）或生物制劑來減輕炎性反應、控制疾病進程，但副作用較大，不易被接受[10]。RA屬于中醫“痹證”的范疇，《素問·痹論》云：“風寒濕三氣雜至，合而為痹也。其風氣盛者為行痹;寒氣盛者為痛痹;濕氣盛者為著痹也”[11]。而壯醫認為RA的病機實質是“網絡阻滯致痹”， 多由風、寒、濕、熱等毒邪乘虛侵入人體阻滯于“龍路”、“火路”干線及網絡而成，氣血運行不暢，導致筋骨肌肉關節疼痛，其壯醫病名為“滾克”， 屬于壯醫“發旺”的范疇，治療當以“祛邪解毒、疏通兩路”為法，使人體三氣同步，達到“陰陽和”的健康狀態[12]。

壯藥龍鉆通痹方是龐宇舟教授研制出治療RA的壯藥制劑，壯藥龍鉆通痹方由飛龍掌血、大鉆、八角楓、兩面針、青風藤、九龍藤、雞血藤、五指毛桃根等藥物組成。方中飛龍掌血、大鉆通調龍路、火路，祛風毒，除濕毒，共為主藥;八角楓祛風除濕，散瘀止痛;兩面針疏通龍路、火路，清熱毒，消腫痛;青風藤調火路，祛風毒，通小便;九龍藤通龍路，調谷道，祛風除濕;雞血藤補血虛，除濕毒，活血通絡;五指毛桃健脾化濕，舒筋活絡;諸藥合用，共奏通調龍路、火路，祛邪解毒，舒筋通絡之功?，F代藥理研究表明，飛龍掌血[13]的有效成分是香豆素類（如Cp.5）和生物堿類（如Cp.9），根部醇提物和水提物具有強大的鎮痛作用，其鎮痛機理可能與抑制PGE2疼痛介質表達有關;大鉆[14]的有效成分是木脂素類（如聯苯環二辛烯型木脂萜）和三萜類，具有抗炎作用，能夠減低AA大鼠模型足趾腫脹程度;八角楓[15]主要有效成分是生物堿、酚苷及蒽醌，ZHAI K F等研究發現八角楓中的水楊酸具有抗炎作用，作用機理可能與抑制金屬蛋白酶-1、-3的表達有關，青風藤[16]富含青藤堿、乙基青藤堿等生物堿類物質，主要有鎮痛、調節免疫系統的作用。由此可見，龍鉆通痹方主要是通過抗炎、鎮痛、調節免疫等作用來治療RA的。

類風濕關節炎發病機制復雜，免疫紊亂相關研究是類風濕關節炎當前研究熱點，新進研究表明Th22在類風濕關節炎中起到重要作用，Th22分泌的效應因子IL-22可能導致RA的炎癥反應而發病[17]。本研究通過構建膠原誘導型關節炎大鼠模型，進一步觀察壯藥龍鉆通痹方干預RA大鼠模型的足跖容積變化，踝關節組織病理改變和對Th22細胞水平與其效應因子IL-22的影響。結果顯示：壯藥龍鉆通痹方高劑量組顯著減小膠原誘導型關節炎模型大鼠的足跖容積，降低踝關節炎癥細胞浸潤，下調膠原誘導型關節炎模型大鼠Th22細胞水平與其效應因子IL-22的表達水平。初步結果顯示，壯藥龍鉆通痹方可能通過抑制Th22細胞以及Th22細胞分泌因子IL-22的產生水平治療RA，然而具體機制有待進一步研究。

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（收稿日期：2020-07-02 編輯：程鵬飛）

基金項目：國家自然科學基金面上項目（編號：81973976）;廣西中醫藥大學校級科研項目（編號：2017MS021）;廣西本科高校特色專業及實驗實訓教學基地（中心）建設項目（壯醫學專業）（編號：桂教高教[2018]52號） 。

作者簡介：張青槐（1980-），男，漢族，碩士，副教授，研究方向為壯醫藥基礎和應用研究。E-mail：57382826@qq.com

通信作者：高慧（1986-），女，漢族，博士，講師，研究方向為中醫、壯醫藥基礎和應用研究。E-mail：qhghzsybd@163.com