鰻鱺腸道微生物抗性基因組成特征的初步分析

黃薇 劉蘭英 羅土炎 劉洋 宋永康

摘要：腸道微生物是抗生素抗性基因（ARGs）的儲存庫，為明確ARGs在魚腸道微生物中的組成特征，本研究以養殖鰻鱺為研究對象，利用高通量測序技術及功能宏基因組學分析方法對鰻鱺腸道微生物ARGs的種類和豐度進行了探究。研究結果顯示，養殖鰻鱺腸道微生物主要由厚壁菌門（Firmicutes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）組成，比對抗性基因數據庫共注釋得到254種ARGs基因，分別歸屬于24類抗性類型，其中高豐度的抗性類型為多肽類抗生素、多重耐藥、氟喹諾酮類、四環素類和β-內酰胺類。以上結果表明，在鰻鱺養殖過程中，出現耐多肽類抗生素、氟喹諾酮類、四環素類、β-內酰胺類以及多重耐藥病原菌的機會相對較高。本研究為抗生素在鰻鱺養殖過程中合理使用提供參考依據，同時也顯示宏基因組測序技術在檢測魚腸道ARGs的可行性和優越性。

關鍵詞：鰻鱺;腸道微生物;抗生素抗性基因;宏基因組學

中圖分類號：S182?文獻標志碼：A?文章編號：1002-1302（2020）21-0057-05

中國是水產養殖大國，水產養殖產量占世界養殖總產量的70%左右，位居世界第一[1]。近年來，隨著集約化水產養殖的迅速發展，水產養殖中的病害問題特別是細菌性病害在密集型的養殖體系中發病率極高，導致抗生素被大量過度使用。雖然抗生素具有殺菌、促進生長等作用，但長期重復使用或過度使用不僅會降低抗生素的藥效，還有可能誘導產生一系列攜帶抗生素抗性基因（antibiotics resistance genes，ARGs）的耐藥性菌株[2]。ARGs作為一項新型環境污染物在2006年被明確提出[3]，成為一個全球性的環境熱點問題，由此而產生的潛在生態風險也日益引起各國政府和研究者的廣泛關注。

水產養殖魚類腸道和糞便內有耐藥菌和ARGs檢出的報道已屢見不鮮[4]。動物腸道本身就是細菌生長繁殖的重要場所，腸道內共生著大量的已知和未知的微生物，環境中抗生素的選擇壓力容易誘導其內在或外源ARGs通過質粒接合轉移等方式傳遞給腸道內的大量敏感菌群變成新的耐藥菌，因此魚類腸道是ARGs定植和轉移的一個非常理想的微環境[5]。研究人員認為，魚腸道為ARGs的轉移和擴散提供了安全而穩定的場所可能是ARGs能夠在水環境中長期穩定存在的重要原因[6]。因此，明確養殖魚體腸道菌群中ARGs的污染特征，對水產養殖環境ARGs的污染評價及生態安全管理具有重要的作用。

傳統研究環境ARGs的方法主要是通過耐藥菌的培養，以及ARGs的PCR和定量PCR篩選等，通過這些方法研究人員已經從不同環境介質中分離和鑒定了大量的ARGs，闡釋了不同ARGs的作用機制[7]。但傳統的研究分析方法具有一定的限制性，如大多的微生物不可培養、PCR結果的真實程度取決于設計引物的序列等，因此很難得到環境中微生物抗生素抗性基因組的全面和詳細的信息。近年來，基于功能的宏基因組篩選和基于高通量測序為基礎的宏基因組測序分析技術與方法的發展為研究環境抗生素抗性基因組的生態、起源、進化和傳播機制提供了強有力的工具[8-9]。Looft等[10]和Xiong等[11]對豬和肉雞腸道微生物組的高通量宏基因組測序分析，使我們對豬和雞的腸道微生物組所蘊藏ARGs的廣度和深度都有了更進一步的理解，同時為微環境下ARGs的傳播和流動提供了有力的證據。然而與陸生脊椎動物相比，水生動物所處生態環境更為復雜，其腸道微生物具有更豐富的多樣性和復雜性，受環境條件和隨機因子的影響，使得魚類腸道微生物比陸地動物更具動態性，直至目前魚類腸道微生物ARGs組的相關性研究也鮮見報道。

鰻鱺（Anguilla sp.）是中國出口創匯最多的水產養殖品種之一，年產值超百億元，是目前單項農產品中創匯最多的品種之一。鰻鱺在人工養殖過程中疾病時有發生，其中細菌性疾病的危害最為嚴重，常造成重大的經濟損失。明確ARGs在鰻鱺腸道微生物中的組成特征，可以為指導鰻鱺養殖抗菌藥物的合理使用提供必要的理論依據，對水產動物源病害防控具有重要的應用價值。本項目擬以養殖鰻鱺為研究對象，運用高通量測序技術及功能宏基因組學分析方法，確定鰻鱺腸道微生物中ARGs的種類和豐度，為鰻鱺的健康養殖、病害防控以及水生態環境調控參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年3月12日，選取福清鰻鱺養殖區的3個典型養鰻場作為采樣點，每個養鰻場隨機網捕3條鰻鱺，體質量200～300 g，送回實驗室。將采集的鰻鱺頭尾固定，表面采用75%乙醇消毒90 s，使用無菌去離子水沖洗3次，將每條鰻鱺用無菌刀解剖，取其腸道，立即放入含15 mL PBS緩沖液、1 mL茶樹油和20 g石榴石（0.7 mm）的無菌50 mL離心管中，用一次性無菌研杵壓碎腸道，在渦流振蕩器中以1 500 r/min的速度振蕩5 min使其均勻化。將勻漿混合物依次通過100、20、11和8 μm的濾膜過濾，去除宿主細胞，再經過0.22 μm濾膜富集微生物，收集的腸道微生物濾膜儲存在-80 ℃下，以提取其總基因組DNA。

1.2 主要試劑

75%乙醇、PBS緩沖液、無菌研杵，購自生工生物工程（上海）股份有限公司;茶樹油、石榴石，購自德國Qiagen公司;100、20、11、8和0.22 μm的濾膜，購自美國Millipore公司;PowerWater DNA Isolation Kit試劑盒，購自美國MOBIO公司。

1.3 DNA提取與純化

取收集好的鰻鱺腸道微生物濾膜，采用PowerWater DNA Isolation Kit 試劑盒提取總基因組DNA，具體提取方法參考試劑盒說明書。提取的基因組DNA樣品用Qubit 2.0核酸蛋白定量儀進行定量，然后放置在-80 ℃下保存直至使用。

1.4 Illumina測序及高通量數據處理

為達到測序要求的DNA閾含量，將9個DNA樣品混合，由上海美吉生物公司采用Illumina Hiseq 2500測序平臺進行宏基因組測序。高通量測序原始數據先采用fastp軟件進行質控去除接頭序列、低質量堿基、N堿基及長度過短序列，利用Megahit與Newbler軟件對質控數據進行多重混合拼接組裝，使用MetaGene軟件對拼接結果中的Contigs進行ORF預測，采用CD-HIT軟件進行聚類（默認參數為：95% identity、90% coverage），每個類取最長的基因作為代表序列，構建非冗余基因集，使用BLASTP軟件將非冗余基因集與NR數據庫進行比對（比對參數設置期望值e-value為1e-5），并通過NR庫對應的分類學信息數據庫獲得物種注釋結果，然后使用物種對應的基因豐度總和計算該物種的豐度，從而構建相應分類學水平上的豐度表，將數據上傳ARDB數據庫（http：//ardb.cbcb.umd.edu/）進行比對（比對參數設置期望值e-value為1e-5），獲得基因對應的抗生素抗性功能注釋信息;將數據上傳CARD數據庫（http：//arpcard.mcmaster.ca/）進行比對（比對參數設置期望值e-value為1e-5），獲得基因對應的抗生素抗性功能注釋信息，綜合CARD和ARDB的注釋結果，繪制鰻鱺腸道微生物基因組抗性基因圖譜。

2 結果與分析

2.1 高通量測序序列數據分析

鰻鱺腸道微生物基因組DNA樣品經宏基因組測序共得到原始序列（Raw reads）50 839 026條，質控后的有效序列（cean reads）50 355 024條，占原始序列的99.45%?；旌掀唇雍蟮玫紺ontigs 65 048條序列，N50為404 bp;經過基因預測得到ORFs的序列條數為406 331，通過聚類構建了200 260個基因的非冗余基因集。

2.2 鰻鱺腸道菌群結構和多樣性分析

利用BLASTP將非冗余基因集與NR數據庫比對進行物種分類注釋，共得到71個門水平、147個綱水平、373個目水平、686個科水平和1 473個屬水平和4 094個種水平的物種，其中注釋為真細菌、病毒、古細菌、真核生物以及未分類物種的序列數分別占總注釋序列數的96.13%、0.17%、0.04%、3.64%和0.02%。從注釋結果中可知真核生物的序列數比例僅為3.64%，說明本研究提取的鰻鱺腸道微生物基因組DNA樣品基本清除了宿主DNA。

從門水平上看，鰻鱺腸道微生物的優勢菌群主要由厚壁菌門（Firmicutes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）組成，其豐度分別占物種注釋序列總數的50.61%、29.31%、14.48%和1.23%，除此之外的其他門類的細菌在鰻鱺腸道樣品中的豐度均較低（圖1）。從屬水平上看，鰻鱺腸道微生物中相對豐度在1%以上的細菌屬主要有乳球菌屬Lactococcus（46.49%）、鯨桿菌屬Cetobacterium（28.27%）、鄰單胞菌屬Plesiomonas（11.59%）、氣單胞菌屬Aeromonas（1.11%）（圖2）。上述結果使我們對鰻鱺腸道菌群多樣性以及優勢菌群結構組成有了更全面的認識。

2.3 鰻鱺腸道微生物基因組抗性基因分析結果

將鰻鱺腸道微生物基因組數據上傳CARD數據庫進行ARGs的預測和注釋。結果顯示，鰻鱺腸道微生物基因組在CARD抗性基因數據庫中共預測得到669 852條ARGs序列，分別屬于235個不同的ARGs。不同抗性數據庫的側重點不同，所收錄的ARGs序列數目、標準以及注釋結果的篩選標準也不相同，導致不同數據比對和注釋結果也不盡相同[12]?；蚪M數據上傳ARDB抗性基因數據庫，共注釋得到27 736條ARGs序列，得到40種ARGs。本研究綜合CARD和ARDB的注釋結果，對鰻鱺腸道微生物的抗性基因類型進行了統計分析，結果見表1。

由表1可知，鰻鱺腸道微生物中共存在ARGs基因254種，歸屬于24類抗性類型。具體包括61種多重耐藥基因、46種多肽類抗生素ARGs、31種氟喹諾酮類ARGs、23種四環素類ARGs、25種β-內酰胺類ARGs、6種大環內酯類ARGs、9種林可酰胺類ARGs、4種利福平類ARGs、1種Microcin J25 ARGs、5種磷霉素類ARGs、5種Elfamycin ARGs、3種異煙肼類ARGs、4種鏈陽霉素A ARGs、1種螺旋霉素類ARGs、8種氯霉素類ARGs、9種氨基糖苷類抗生素ARGs、3種磺胺類ARGs、1種羰基氰化物間氯苯腙（CCCP）ARGs、1種夫西地酸類抗生素ARGs、1種阿霉素ARGs、4種甲氧芐啶類ARGs、1種硝基呋喃類ARGs、1種莫匹羅星類ARGs和1種春雷霉素類ARGs。統計結果表明，鰻鱺腸道微生物中存在種類多樣且豐富的ARGs庫。

在CARD的注釋結果中，豐度最高的ARG為氟喹諾酮類抗性基因mfd，豐度最高的抗性類型為多肽類抗生素;在ARDB注釋結果中，豐度最高的ARG為四環素類抗性基因tetS，豐度最高的抗性類型為四環素類。綜合CARD和ARDB的注釋結果，鰻鱺腸道微生物ARGs中較高豐度的抗性類型為多肽類抗生素、多重耐藥、氟喹諾酮類、四環素類和β-內酰胺類。表明在鰻鱺養殖過程中，出現耐多肽類抗生素、氟喹諾酮類、四環素類、β-內酰胺類以及多重耐藥病原菌的機會相對較高。

3 討論

環境ARGs的種類和豐度與細菌群落結構組成密切相關[13]。研究表明，不同菌種攜帶ARGs的偏好性不同，優勢菌群對環境ARGs的組成特征扮演著重要角色[14]。宏基因組測序方法不僅可以檢測ARGs的廣譜特征，同時還能檢測出環境微生物群落結構組成。測序分析結果顯示，鰻鱺腸道微生物中的優勢菌群由厚壁菌門（Firmicutes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）組成，這個結果與之前筆者所在課題組采用16S rRNA基因高通量測序分析得到的優勢菌群[15]是一致的，說明本研究的宏基因組測序結果可靠性較高。但2種研究方法得到的優勢菌群的分布比例有較大差異，分析原因可能是不同的鰻鱺腸道樣本的微生物菌群豐度本身就存在較大差異，同時也可能與不同基因組16S rRNA基因的PCR擴增的特異性有關。此外，鰻鱺腸道的優勢菌門和優勢菌屬與已知斑馬魚[16]、草魚[17]和虹鱒魚[18]的腸道優勢菌群結果相似，說明魚類腸道微生物的種類結構相似。

從ARGs注釋結果可知，本研究共在鰻鱺腸道中檢測出254種ARGs，發現了許多在魚類腸道未曾報道過的ARGs，如tlrC、YojI、emrB等。導致這些基因未曾報道的原因可能是由于這些基因的宿主（耐藥菌）難以培養或是用于擴增這些基因的引物難以設計，這也進一步說明宏基因組測序分析方法比傳統方法更能全面的檢測出樣品中的ARGs[19]。Tamminen等在6年未使用過抗生素的水產養殖場中仍檢測到3種編碼四環素的ARGs[20]。本研究在鰻鱺腸道中，同樣檢測出了氯霉素類、硝基呋喃類、磺胺類、β-內酰胺類以及人用抗生素等多種禁用漁藥的ARGs，由此可以說明水產養殖場已經成為環境中ARGs的儲存庫。某些ARGs一旦轉移到病原菌中，將使魚病治療面臨更多的新挑戰，同時腸道中的細菌密度極高又極大地增加了基因橫向轉移的風險，這些ARGs可能通過多種途徑（如食物鏈）最終傳遞到人體中。

鰻鱺腸道微生物中豐度最高的抗性類型為多肽類抗生素、多重耐藥、氟喹諾酮類、四環素類和β-內酰胺類。多肽類抗生素、氟喹諾酮類、四環素類和β-內酰胺類均為水產養殖中常用的動保產品，尤其是多肽類抗生素，由于其添加在飼料中不影響適口性，對水產動物具有促生長、提高飼料轉化率的效果，常常作為飼料添加劑廣泛使用，大多數的種類都沒有殘留限量要求[21]。在鰻鱺腸道中，檢測出多重耐藥基因61種，在CARD數據庫比對結果中，這些多重耐藥基因占ARGs基因總數的12.95%，基因的多重耐藥性已經在許多研究中被證實[19]?？股氐氖褂眉皻埩舻沫h境選擇壓力與抗生素抗性的產生密切相關[3]。鰻鱺腸道中檢測出豐度較高種類繁多的多重耐藥基因可能與鰻鱺環境中使用的多種抗生素造成的微生物選擇壓力或者細菌之間ARGs的交換有關[22]。由此可知，水產養殖中抗生素的濫用和過度使用狀況不容樂觀。本研究采用宏基因組測序分析技術明確了鰻鱺腸道中ARGs的污染特征，可以為指導鰻鱺養殖抗菌藥物的監管提供必要的參考依據，對水產動物源病害防控具有重要的應用價值，同時也表明宏基因組測序技術檢測ARGs具有的可行性和優越性。

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