高效液相色譜法測定過瘤胃賴氨酸鹽酸鹽的含量

趙 威，徐振興，吳月敏，吳麗艷，于思婷，徐二華，王 效

（1.杭州康德權飼料有限公司，杭州 311107; 2.包膜飼料添加劑省級重點企業研究院，杭州 311107）

賴氨酸作為“第一缺乏氨基酸”，在生物體內的代謝起著重要的作用，而被廣泛用于食品、醫藥及飼料等工業。飼料中添加賴氨酸可提高蛋白質的利用率，強化飼料營養，易于動物消化吸收，增加料肉比[1]。由于賴氨酸易吸潮，因而在實際生產中都以賴氨酸鹽酸鹽或賴氨酸硫酸鹽形式加以利用，以便于貯存、運輸與使用。

反芻動物同樣需要賴氨酸，若直接添加晶體氨基酸，在瘤胃內會發生脫氨基作用達不到添加效果，而且會增加糞氮、尿氮排放[2]。若將氨基酸包膜，使氨基酸能通過瘤胃不被破壞，不僅能提高反芻動物生產性能，還能降低日糧蛋白水平，減少糞氮、尿氮排放，提高生產效益。

目前賴氨酸鹽酸鹽的檢測方法有高氯酸滴定法[3，4]、凱氏定氮法、甲醛加入滴定法[5]及衍生法液相色譜測定等方法[6]。在我國，現行的行業和國家檢測標準（NY39－87和GB10794－2009），所采用的方法是非水滴定法，其中用到的試劑有：高氯酸滴定液、冰醋酸溶液、乙酸汞溶液，上述試劑或腐蝕性強，或為劇毒試劑，不但不易獲得而且其操作對環境不友好，不利于大批量產品的質量控制。而液相色譜檢測方法能進行批量檢測，檢測數據穩定可靠，樣品為色譜分離檢測，相比滴定法所受的干擾較小。本研究建立了高效液相色譜法測定過瘤胃賴氨酸鹽酸鹽含量的方法，為過瘤胃賴氨酸鹽酸鹽質量標準的建立和產品質量控制提供依據。

1 儀器與試藥

賽默飛 U3000高效液相色譜儀（備有紫外檢測器）；變色龍6.8色譜工作站。

L-賴氨酸鹽酸鹽標準品（MACKLIN，批號：C10429138）；過瘤胃賴氨酸鹽酸鹽樣品（杭州康德權飼料有限公司提供，批號為190516、190518、190520）。

2 色譜條件與系統適應性試驗

色譜柱：Agela Technologies，Venusil MP C18（4.6×150mm,5μm）；流動相：乙腈∶0.017mol/L庚烷磺酸鈉溶液（取1.7g庚烷磺酸鈉置于500mL量瓶中，加入0.1mLH3PO4，用純水稀釋并定容至刻度）=15:85，進樣量20μL，檢測波長195nm；流速1mL/min。此色譜條件下，由賴氨酸鹽酸鹽對照品溶液和供試品溶液分析可知，出峰時間一致，均為3.68min，且溶劑無干擾。

在上述色譜條件下分別取對照品溶液、供試樣品溶液和陰性對照溶液各20μL進樣分析，結果表明：理論板數按賴氨酸鹽酸鹽計算不低于4000，色譜峰分離度良好。對照品、供試樣品和陰性對照溶液色譜圖見圖1。

圖1 對照品、供試樣品和陰性對照溶液色譜圖

3 方法與結果

3．1 溶液制備

對照品溶液：精密稱取對照品賴氨酸鹽酸鹽0.25g，置100mL量瓶中，加超純水約20mL溶解，用超純水定容至刻度，搖勻，制每1mL含賴氨酸鹽酸鹽約2.5mg的對照品溶液。

供試樣品溶液：稱取50%過瘤胃賴氨酸鹽酸鹽樣品約0.1g，精密稱定，置于100mL容量瓶中，加超純水約50mL，置于100℃沸水中水浴煮沸約5min，取出放冷至室溫，加超純水定容至刻度，搖勻，備用。

3．2 線性關系考察

分別精密量取賴氨酸鹽酸鹽對照品溶液0.10、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL，分別置于10mL量瓶中，加超純水溶解并定容至刻度，搖勻，分別得賴氨酸鹽酸鹽濃度為0.025、0.125、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25mg/mL的溶液，分別進樣20μL測定。以對照品溶液濃度（X，mg/mL）為橫坐標，以對照品峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線，賴氨酸鹽酸鹽回歸曲線方程為：Y=22.663X+0.1964（r2=0.9997）。賴氨酸鹽酸鹽在0.025～1.25mg/mL范圍內，與峰面積成良好線性關系。

3．3 精密度試驗

取對照品溶液在上述色譜條件下連續進樣6次，峰面積的RSD結果為：0.06%。

3．4 重復性試驗

取同一批號的50%過瘤胃賴氨酸鹽酸鹽6份，批號為190516，每份取樣品約0.1g，精密稱定，按3.1方法操作。在上述色譜條件下進樣分析，結果賴氨酸鹽酸鹽的平均含量為50.52%，RSD為0.03%，表明重復性良好。

3．5 穩定性試驗

取同一供試品溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、12h，在上述色譜條件下進樣分析，計算賴氨酸鹽酸鹽峰面積的RSD，結果為0.35%。結果表明供試品溶液在12h內穩定性良好。

3．6 回收率試驗

取已知含量的過瘤胃賴氨酸鹽酸鹽9份，批號為190516，每份取粉末約0.1g，精密稱定，分別精密加入低、中、高3種濃度的對照品溶液，同上法操作，在上述色譜條件下分析，計算平均回收率。加樣回收率測定結果見表1。

3．7 樣品測定

精密稱取50%過瘤胃賴氨酸鹽酸鹽樣品約0.1g，置于100mL量瓶中，按3.1項下的方法操作，在上述色譜條件下對3批次過瘤胃賴氨酸鹽酸鹽進行分析，計算含量，結果見表2。

表1 回收率試驗結果

表2 50%過瘤胃賴氨酸鹽酸鹽樣品測定結果（n=3）

3．8 檢出限與定量限

圖2 檢出限（C）、定量限（D）液相色譜圖

取賴氨酸鹽酸鹽對照品適量，加超純水溶解并稀釋制成一系列濃度的溶液，取20μL注入液相色譜儀，測得賴氨酸鹽酸鹽最小檢出限為0.25μg（S/N≥3），定量限為2.5μg（S/N≥10）。檢出限和定量限色譜圖見圖2。

3．9 方法的比較

取3批次樣品，分別采用高氯酸滴定的國標法與本液相法檢測，結果本法含量平均值為50.42%，RSD為0.02%，高氯酸滴定法平均值為50.43%，RSD為0.05%（表3）。檢測結果表明，本法與高氯酸檢測結果一致，無顯著差異。

表3 樣品測定比較

4 討論

4．1 流動相和波長的選擇

陸淳等[7]用高效液相色譜法測定飼料級賴氨酸鹽酸鹽，以pH1.5的水為流動相，檢測波長為195nm，結果該方法在緊鄰樣品主峰前有個小的未知峰出現，會影響色譜峰積分，且色譜柱長時間用水做流動相對柱效也會產生影響。由于賴氨酸鹽酸鹽含有鹽酸根離子，故本研究的流動相嘗試使用離子對試劑，選擇了庚烷磺酸鈉磷酸溶液和乙腈配比的流動相；當用紫外分光光度計對樣品溶液在190～300nm處進行波長掃描時發現，檢測波長在195nm左右時有最大吸收峰，故檢測波長選擇195nm。最終，以離子對試劑的乙腈溶液作為流動相，在195nm的波長下，樣品溶液色譜峰出峰正常，色譜峰的前后1min均無明顯未知峰出現，避免了干擾，提高了色譜峰積分的準確性和重現性。

4．2 溶劑的選擇

賴氨酸鹽酸鹽易溶于水[8]，樣品溶劑分別選用了流動相和水，發現流動相溶解的樣品色譜圖分離不好，峰型不對稱，而直接用水溶解的樣品峰型對稱，分離效果好。故采用水作為樣品溶劑。

4．3 樣品前處理方法選擇

過瘤胃賴氨酸鹽酸鹽樣品選擇了棕櫚油為主要包膜材料，由于樣品外層包裹了一層油脂，直接超聲不能溶解樣品，故需要在沸水浴中加熱至樣品溶液中顆粒物全部融化成透明液體，大約需要2min時間。這樣賴氨酸鹽酸鹽才能充分從包膜材料中釋放出來，溶解到溶劑中，經冷卻后定容，即可上機測定。

本研究建立了高效液相色譜法測定賴氨酸鹽酸鹽的分析方法，使用的溶劑為水，方法快速、準確、重復性好，可作為賴氨酸鹽酸鹽的質量控制方法。