豬膀胱脫細胞基質制備的實驗研究

鄧 飛，胡幗穎，顧漢卿

(1.北京市順義區醫院泌尿外科，北京101300；2.天津市泌尿外科研究所，天津300211)

膀胱大面積缺損由腫瘤、結核等原因引起的是臨床難題。胃腸道替代膀胱是目前最常用的方法，該方法不僅造成供區的創傷，而且還存在許多并發癥。近年來，隨著組織工程技術的發展，通過脫細胞方法，可以將產生于膀胱的膀胱粘膜下基質作為細胞支架，再生膀胱組織，以達到修復及擴大膀胱的目的，去除膀胱內細胞、抗原等成分，使其表面光滑，結構相對致密，有利于尿路上皮的粘附，且能有效阻止尿液滲入腹腔。研究者為了尋找能完全再生而無不良反應的擴大及替代膀胱的材料，已經進行了多年的研究。Meezan的脫大鼠膀胱組織的方法是最早報道的，后來的許多研究都是基于這一方法。豬與大鼠的膀胱組織不同，其膀胱平滑肌纖維較厚、粗大、機械強度高、脫細胞技術要求高，使用Meezan方法不能制備出合格的豬膀胱脫細胞基質，以Meezan方法為對照組。本實驗采用改進的Meezan的方法作為實驗組，制備出符合脫細胞技術要求的豬膀胱脫細胞基質。

1 材料和方法

1.1 試劑

牛胰脫氧核糖核酸酶-I(DNAse-I)，牛胰核糖核酸酶-A(RNAse A)，脫氧膽酸鈉，疊氮鈉。

1.2 儀器與材料

恒溫磁力攪拌器，電熱式蒸汽消毒器，生物顯微鏡，手術相關器械，微孔濾膜濾器，微孔濾膜(膜孔=0.2 μm)等。

1.3 溶液配制

(1)配制200 mL 1 mol/L NaCl含 DNAse-I 2 000 kU溶液:NaCl 11.7 g，加入200 mL三蒸水，完全溶解混勻分裝，高溫高壓蒸汽消毒滅菌。稱量DNAse-I 3.2 mg，(600 ～1 000 kU/mg)，加入滅菌的200 mL 1 mol/L NaCl溶液中，4℃保存備用。(2)配制200 mL 1 mol/L NaCl含 DNAse-I 2 000 kU、RNAse 2 000 kU溶液:稱量 DNAse-I 3.2 mg，RNAse 5 mg(400 kU/mg)，加入滅菌的200 mL 1mol/L NaCl溶液中，4℃保存備用。(3)磷酸鹽緩沖鹽(PBS)溶液:NaCl 8.00 g/L，KCl 0.20 g/L，NaHPO1.56 g/L，KHPO0.20 g/L，將混勻的PBS溶液分裝鹽水瓶內，高溫蒸汽消毒滅菌，三蒸水配制7.4% NaHCO溶液1 000 mL，微孔濾膜過濾除菌，用NaHCO溶液調節PBS溶液pH值為7.2～7.4，4℃保存備用。(4)配制4%脫氧膽酸鈉和100 mL 0.1%疊氮鈉溶液:分別稱量脫氧膽酸鈉4 g和疊氮鈉0.1 g，放入100 mL三蒸水中，充分混勻，4℃保存備用。

1.4 制備方法

1.4.1 取材與預處理方法 醫用實驗級小型豬為取材動物，體重約25 kg。手術當天，使用靜脈注射氯胺酮方法麻醉，豬翻身至仰臥位，取下腹部正中切口。手術區碘酒酒精消毒，縱切皮膚、皮下脂肪層和肌肉層，拉開兩側肌肉，腹膜顯露。切開腹膜后，進入腹腔，分開腸管，可見盆腔內充盈的膀胱，分離膀胱周圍的筋膜組織，找到兩側的輸尿管連接部及膀胱頸，在此結扎切開，取下完整的膀胱。把膀胱尿液放盡，從中部縱行剪開膀胱，露出內腔面，可見膀胱內面的粘膜層，用PBS溶液反復沖洗膀胱。在0.1%疊氮鈉-PBS溶液中保存，加入預處理后的膀胱雙抗抗菌溶液，密封，4℃保存備用。

1.4.2 豬膀胱脫細胞基質的制備

1.4.2.1 對照組:Meezan方法。取出預處理后的膀胱，用刀片刮去膀胱粘膜層，保留粘膜下的肌層及漿膜層，用PBS溶液反復沖洗3次后放在200 mL 1 mol/L NaCl含2 000 kU DNAse溶液中，放置在恒溫振蕩器內，保持37℃，轉速150次/min，時間10 h后取出，PBS溶液反復清洗3次后，放在100 mL 4%脫氧膽酸鈉溶液中，37℃，恒溫振蕩，轉速150次/min，時間10 h。共進行2次，PBS溶液反復清洗3次。取出0.5 cm×0.5 cm左右的基質，PBS溶液沖洗，福爾馬林溶液固定，行病理切片，HE染色。將制備的基質儲存于0.1%疊氮鈉-PBS溶液中，加入雙抗溶液，密封，4℃保存。

1.4.2.2 試驗組:本試驗改進方法。方法步驟同上，只是處理后的膀胱放入200 mL 1mol/L NaCl含2 000 kU DNAse和2 000 kU RNAse溶液中。

2 結果

2.1 正常的豬膀胱粘膜下組織病理切片結果

參見圖1。結果顯示，平滑肌組織的纖維結構，其間有細胞存在，成簇分布。

圖1 正常豬膀胱粘膜下組織病理切片結果

2.2 對照組Meezan方法病理切片結果

參見圖2。結果顯示，排列整齊的膠原纖維，細胞順纖維方向均勻分布，細胞仍大量存在。

圖2 Meezan方法病理切片結果

2.3 實驗組改進的方法病理切片結果

參見圖3。結果顯示，膠原纖維排列整齊，無細胞出現，也無細胞碎片存在，但細胞脫去后仍可見到結構。因此，制備的豬膀胱脫細胞基質符合脫細胞技術要求。

圖3 本試驗方法病理切片結果

3 討論

Meezan最早報道的大鼠膀胱脫細胞基質支架制備方法:將大鼠膀胱置于35 mm培養皿中，加入50 mL 10 mmol/L PBS-0.1%的疊氮鈉溶液。膀胱粘膜層用刀片刮去，留下平滑的肌層和漿膜層，用50 mL 10 mmol/L PBS-0.1%疊氮鈉溶液處理，攪拌5～6 h。用40 mL PBS溶液沖洗后，再用含2 000 kU DNAse的50 mL 1 mol/L NaCl溶液處理，攪拌6～8 h。再用0.1%疊氮鈉-4%脫氧膽酸鈉溶液50 mL處理，攪拌5～6 h，必要時可重復攪拌1次。制成的基質使用PBS溶液清洗，儲存在40%的硫酸新霉素中，密封，4℃保存。Wu等類似于 Meezan的方法，從成年 Sprague Dawley鼠取出膀胱，放入蒸餾水中攪動1 h，使細胞水解。接著用4%脫氧膽酸鈉溶液作用2～4 h，最后放在2000 kU DNAse-I的1 mol/L NaCl的溶液中作用2 h。將BAM置于PBS溶液中，溫度4℃。這種方法的特點是和Meezan方法次序互換，制備時間縮短。

近年來，為避免使用人工合成材料或非泌尿系組織替代材料所帶來的并發癥，研究人員積極嘗試利用天然細胞外基質進行膀胱的修補與替代，采用基質移植膀胱脫細胞化的方法進行膀胱組織的替代重建，并且在動物實驗方面取得了可喜的研究成果。膀胱脫細胞基質是利用生物酶和相關試劑除去膀胱組織中的細胞和細胞碎片，留下細胞外基質，成為無細胞和富含膠原、彈性蛋白、平滑肌結構、血管框架的基質。這種材料具有良好的生物相容性和機械穩定性，可以作為細胞支架用于新生膀胱組織的生長替代重建，完成膀胱缺損的修補、成形、重建，完成膀胱的儲尿和排尿功能。Piechota等研究認為，膀胱脫細胞基質移植物能完全再生膀胱壁的所有成分，體外實驗研究再生的膀胱平滑肌纖維束與宿主的膀胱平滑肌纖維束相比，收縮力高達50%左右。Probst等使用膀胱脫細胞基質移植物用于膀胱擴大術，由于材料取自膀胱組織，類似于宿主膀胱的機械性能、結構和遺傳特性，經處理后又明顯降低了抗原性，移植效果相當滿意。膀胱脫細胞基質移植物在同種異體和異種移植中的良好表現及簡單的制備過程，將推動其在未來的臨床應用。

本研究首先采用Meezan的方法制備膀胱脫細胞基質，由圖2可見脫細胞效果不佳，且殘留細胞較多。分析失敗原因可能因為豬與大鼠的膀胱組織不同，豬的膀胱平滑肌纖維更厚實粗大，機械強度高，脫細胞技術要求高，不能制得合格的豬膀胱脫細胞基質。我們根據文獻報道血管脫細胞基質的制備方法，結合豬膀胱組織的特點，在生物酶解液中加入了RNAse，配合DNAse的酶解作用，并且把膀胱制成組織片斷，便于生物酶進入到組織內部，進行實驗。溫度維持在37℃，有利于最大程度發揮酶解作用。病理切片(圖3)顯示，基質內脫去了細胞及細胞碎片，只留下排列稀疏的纖維組織，纖維之間有許多空穴，而且順纖維方向排列，推測可能是細胞在不斷攪動震蕩時，細胞順纖維方向重新分布，當用脫氧膽酸鈉脫去細胞膜和細胞內的脂質，細胞被破壞分解進入到清洗液中，細胞脫去后就在基質留下空穴。對比圖2和圖3，可見圖2的細胞順纖維分布，圖3中相應的區域有明顯的空穴，可以證明判斷的正確性。

不僅我們的研究發現Meezan的方法不能制得合格的豬膀胱脫細胞基質。許多研究者也有同樣的結論，對制備方法進行了改變，主要是針對豬膀胱脫細胞基質制備的高技術難題。如Merguerian等報道的豬膀胱脫細胞基質制備方法。整個膀胱最先放在三羥甲基氨基甲烷(Tris)/KCl/EDTA和1% Triton溶液中，后放入Trizma/EDTA溶液中。然后用配備的DNAse和RNAse溶液處理后，在Tris/SDS溶液中攪動。SDS提取后，放在70%乙醇溶液中，存儲在Dulbecco's PBS溶液中，放入冰箱中。另外，Brown等的方法要求更高，其材料來自屠宰場的豬，因此脫細胞技術含量更高。在30 min內，從豬體內迅速取出膀胱，進行一系列脫細胞技術處理。整個膀胱放在低滲的Tris緩沖液中(pH=8.0)，含有蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride)，濃度為0.35 mL/L，室溫下不斷攪動48 h。接著放在含有1% Triton X-100和蛋白酶抑制劑的tris緩沖液，持續攪拌48 h。取出膀胱，PBS溶液清洗30 min后，室溫下使用DNAse和RNAse作用10 h。再次用PBS溶液清洗，使用含有SDS的Tris緩沖液完成進一步脫細胞過程，時間為48 h。放入PBS溶液24 h后，制備的基質再用70%的乙醇消毒后使用。

我們在制備方法中，結合了Merguerian PA和Brown AL方法的特點，但他們方法步驟較多，時間長。我們將整個制備過程分為4個質量控制環節:PBS溶液水解細胞、生物酶分解細胞內成分、清除細胞脂質和PBS溶液清洗。我們在制備方法上，在Meezan方法基礎上，在 DNAse酶解過程中加入RNAse，病理切片顯示基質內無細胞及細胞碎片，獲得了合格的膀胱脫細胞基質。

綜上所述，本實驗通過使用200 mL 1mol/L NaCl含DNAse-I 2 000 kU和RNAse 2 000 kU溶液，將處理后的膀胱粘膜下基質，在37℃恒溫振蕩10 h，轉速150次/min，PBS溶液反復清洗3次后放在100 mL 4%脫氧膽酸鈉溶液中，37℃恒溫振蕩10 h，轉速150次/min，進行2次，PBS溶液反復清洗3次，制備出豬膀胱脫細胞基質，滿足了脫細胞要求，可以作為支架用于動物移植的實驗研究。