兩種前列腺素抑制二磷酸腺苷誘導血小板聚集強弱的體外對比

夏 晴，李 藝，李 薇，胡惠靜，陳 云，阮競雄

依前列醇，又名前列腺素I2(prostaglandin I2, PGI2)，為血管內產生的一種天然前列腺素，是強效的血管擴張藥及抗血小板聚集藥[1,2]。其抗血小板聚集的作用機制可能為本藥激活腺苷酸環化酶，而使血小板內環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, AMP)濃度上升所致。臨床上用于治療不穩定型心絞痛、心肌梗死、頑固性心力衰竭、外周血管痙攣性疾病及肺動脈高壓[3,4]。前列地爾，又稱前列腺素E1(prostaglandin E1, PGE1)，可增加血管平滑肌細胞內的cAMP含量，發揮其擴血管作用，具有恢復紅細胞變形能力、增加動脈血流量、促進側支循環、降低外周阻力、降低血液黏度的作用，同時可抑制血小板聚集[5，6]。臨床上以脂微球為藥物載體的靜脈注射用前列地爾制劑，主要用于治療慢性動脈閉塞癥(血栓閉塞性脈管炎、閉塞性動脈硬化癥)引起的四肢潰瘍及微小血管循環障礙引起的四肢靜脈息痛，起到很好地擴血管抑制血小板聚集作用[7]，廣泛用于腦梗死[8]、糖尿病并發癥、耳鳴及慢性肝炎[9]，還可用于高血壓視網膜病變[10]。目前，研發拮抗ADP誘導血小板聚集的藥物已成為熱點問題，并取得了一定的研究成果[11]。本研究旨在探討依前列醇鈉、前列地爾對血小板聚集的影響程度及作用強弱，以便為其臨床應用提供藥理理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器 Sysmes XS-800i 全自動血細胞分析儀(日本希森美康公司)； Helena Aggram 四通道血小板聚集儀(美國海倫娜公司)；Sartorius BS224S天平(德國賽多利斯公司)；高速冷凍離心機Sigma 3-30K(德國Sigma離心機股份有限公司)。

1.1.2 材料 SD雄性大鼠250～300 g，20只(西安交通大學醫學院提供)；依前列醇鈉(Caymanpharma s.r.o.，批號1605V011)；前列地爾(吉林英聯生物制藥股份有限公司，批號20150401)；甘氨酸(天藥藥業股份有限公司，批號AGLY140707)；磷酸氫二鈉(湖南九典制藥，批號201601105)；磷酸二氫鈉(成都華邑藥業輔料，批號20120402)；3.2%枸櫞酸鈉抗凝管(w/v，西安交通大學第一附屬醫院提供)；氫氧化鈉(天津市天力化學，批號20160708)；實驗用水為純化水。

1.2 實驗方法

1.2.1 血小板混懸液的制備 SD雄性大鼠且最近2周內未服用過影響血小板功能的藥物，10%水合氯醛麻醉后，腹腔靜脈取血置于加有3.2%枸櫞酸鈉的抗凝管中，800 r/min下離心10 min，吸取上層的富血小板血漿(PRP)，4000 r/min下離心10 min，吸取上層的貧血小板血漿(PPP)。用PPP稀釋PRP最終血小板數為400×109個/L，作為最終血小板混懸液待用。血小板聚集實驗在采集血標本后3 h內進行。

1.2.2 緩沖溶液配制 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液(pH=10.4)：稱取1.5049 g甘氨酸、0.8018 g氫氧化鈉分別溶解在100 ml注射用水中，制得0.2 mol/L水溶液；量取25 ml上述甘氨酸水溶液加入19.3 ml上述氫氧化鈉水溶液混勻后，加入注射用水定容至100 ml得甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液。

磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.5)：稱取7.1640 g磷酸氫二鈉，2.7625 g磷酸二氫鈉分別溶解在100 ml注射用水中，制得0.2 mol/L水溶液；取84 ml上述磷酸氫二鈉水溶液加入16 ml上述磷酸二氫鈉水溶液混勻后即得。

1.2.3 藥液的配制 精密稱取5 mg依前列醇鈉置

于10 ml量瓶中，臨用時用甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液溶解定容，配制質量濃度為500 μg/ml溶液待用；同理，精密稱取5 mg前列地爾置于10 ml量瓶中，用1.2.2項下配制的磷酸鹽緩沖液溶解定容，配制成質量濃度為500 μg/ml溶液待用。然后分別用各自緩沖溶液稀釋至50、125、250、500和2500 ng/ml。

血小板聚集儀自帶ADP試劑，用1 ml蒸餾水復溶1瓶試劑，輕輕混合直至完全溶解至濃度為200 μM，復溶后試劑保存在2～6 ℃可穩定1周，工作液應在制備后3 h內使用。使用時用蒸餾水稀釋至所需濃度。

1.2.4 最佳孵育時間的確定 血小板混懸液中分別加入依前列醇鈉500 ng/ml、前列地爾500 ng/ml，37 ℃下孵育不同時間(0、1、3、5、10、15 min)，在相同的ADP濃度(20 μM)誘導下測定5 min內最大聚集率。

1.2.5 最佳ADP終濃度的確定 血小板混懸液中加入依前列醇鈉500 ng/ml、前列地爾500 ng/ml，37 ℃下孵育相同時間(由1.2.4確定)，在不同濃度的ADP誘導下(5、10、20、40 μM)測定5 min內最大聚集率。

1.2.6 樣品處理 225 μl血小板混懸液中分別加入空白試劑(0，對照組)、50、125、250、500、2500 ng/ml的依前列醇鈉或前列地爾20 μl，37 ℃下孵育相同最佳時間后加入20 μl最佳濃度的ADP誘導，依次檢測各濃度5 min內最大聚集率，計算血小板聚集抑制率，計算公式如下：

血小板聚集抑制率(%)=

2 結 果

2.1 不同孵育時間對血小板聚集的影響 隨著孵育時間的延長，兩組對ADP誘導的血小板聚集均呈現出逐漸降低的趨勢，直至5 min往后血小板聚集率變化無統計學意義差異(P>0.05，表1)。

表1 大鼠兩種前列腺素(500 ng/ml)不同孵育時間的血小板聚集率

注：與前一時間點相比，①P<0.05

2.2 不同ADP終濃度對血小板聚集的影響 血小板混懸液中血小板數控制在400×109個/L，孵育最佳時間為5 min，加入20 μl不同濃度的ADP，隨著ADP濃度的增加血小板聚集率呈增加趨勢。20 μmol/L與10 μmol/L相比具有統計學意義差異(P<0.05)，與40 μmol/L相比差異無統計學意義(表2)。

表2 大鼠兩種前列腺素(500 ng/ml)不同ADP濃度的血小板聚集率

注：與5 μmol/L比較，①P<0.05；與10 μmol/L比較，②P<0.05

2.3 不同濃度的依前列醇鈉、前列地爾對血小板聚集的影響 依前列醇鈉和前列地爾隨著濃度的增加，血小板最大聚集率依次減小，與各自溶劑組相比均顯著降低。依前列醇鈉組血小板抑制率顯著高于前列地爾組，250 ng/ml的依前列醇鈉對血小板的抑制率已經高達88.61%，而前列地爾僅有23.16%。2500 ng/ml的前列地爾血小板抑制率為65.09%，較250 ng/ml的依前列醇鈉血小板抑制率降低(表3)。

表3 大鼠不同濃度依前列醇鈉、前列地爾的血小板聚集率和抑制率

注：-表示無法計算；與無加藥組相比，①P<0.05；與前列地爾等同濃度相比，②P<0.05；與前列地爾等濃度相比，③P<0.05時t值和P值

3 討 論

血小板在不同患者、不同疾病和不同疾病階段中所起的作用不同，影響血小板聚集的因素很多，因此應通過實驗研究為開發新型的具有抗血小板作用的藥物是非常有必要的，而血小板聚集是血小板活化及其釋放反應、膜糖蛋白受體等綜合因素的共同表現，其聚集率的檢測，已被廣泛應用于血栓性疾病及出血的診斷、治療和療效評估[12]。

依前列醇鈉是花生四烯酸的代謝物，具有有效血管擴張活性和血小板聚集抑制活性，是唯一一個進入肺循環不被降解，可發揮全身作用的前列腺素類物質[13]。前列地爾是前列腺素的一種，也具有擴張血管和抑制血小板聚集的活性。本試驗比較了兩者在體外抑制ADP誘導血小板聚集作用的強弱。

研究發現，依前列醇鈉很不穩定，在人體血液環境中很快降解失活。依前列醇鈉在23 ℃、pH 7.2水溶液中半衰期僅為0.033 h，在堿性pH 8.9水溶液中半衰期為4.4 h、pH 9.3情況下半衰期可達到10.33 h，在pH 10.2～10.8依前列醇鈉最穩定[14,15]，故本試驗采用甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液(pH 10.4)作為依前列醇鈉溶劑。依據中國藥典有關前列地爾溶解性的記載，即前列地爾可溶解與pH 7.5磷酸鹽緩沖溶液中，故本實驗采用磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖溶液(pH 7.5)作為前列地爾的溶劑。二磷酸腺苷 (ADP) 是第1個已知的低分子血小板弱聚集誘導劑，可誘導初級聚集和致密顆粒分泌[16]，通過作用于多種受體，增強自身及其他誘導劑對血小板的誘導作用并有助于血栓的穩定[17]，本實驗采用ADP作為血小板聚集誘導劑，在最佳孵育時間和最佳ADP濃度，依次分別加入不同濃度的依前列醇鈉和前列地爾測定5 min內最大聚集率，并計算最大抑制率。

試驗結果表明，大鼠靜脈取血，制備得400×109個/L血小板混懸液，ADP最佳誘導濃度為20 μM，加入藥物最佳孵育時間5 min。依前列醇鈉50 ng/ml、前列地爾250 ng/ml以上濃度均可顯著抑制血小板聚集。依前列醇鈉具有較強的血小板聚集抑制率，500 ng/ml時最大抑制率可達93.90%。前列地爾也可抑制血小板聚集，但其作用強度遠弱于依前列醇鈉，500 ng/ml時最大抑制率僅有28.10%，同等濃度下，依前列醇鈉抑制血小板聚集的作用要顯著強于前列地爾。這與體內研究結果相吻合，即體內研究表明依前列醇鈉是一種強有力的血小板抑制劑，其作用效果是前列地爾的20倍。

綜上所述，依前列醇鈉是一種作用強度遠強于前列地爾的血小板聚集抑制劑，為依前列醇鈉用于治療血小板聚集引起的相關疾病奠定了理論基礎，也為治療血小板聚集相關疾病提供了一種更強有力的選擇。