氧糖剝奪再灌注后星形膠質細胞活化、損傷、凋亡、自噬變化及意義

膽迎，李晨

天津市第五中心醫院，天津300450

腦卒中是由于腦組織缺血或出血導致局部供血中斷而引起腦組織損傷的嚴重疾病，可導致神經功能障礙、神經退行性疾病甚至死亡[1～3]。星形膠質細胞作為腦內最為豐富的神經膠質細胞，負責水和電解質穩態、谷氨酸攝取、腦血流調節、血腦屏障的維持、神經可塑性的調節以及神經營養和神經保護因子的分泌[4～6]。腦缺血后星形膠質細胞活性降低[7]。減輕星形膠質細胞在腦缺血期間損傷是研究的主要方向。自噬通過降解受損細胞器和錯誤折疊的蛋白質以維持細胞穩態和正常細胞功能[8]。缺血性卒中后，大腦中各種類型細胞中自噬被激活。然而，自噬在缺血性腦卒中過程中的具體作用和分子機制尚未闡明[9]。2019年1～10月，本研究采用體外培養的原代小鼠星形膠質細胞制作氧糖剝奪再灌注(OGD/R)模型模擬體內腦卒中損傷，觀察了OGD/R后星形膠質細胞活化、損傷、凋亡、自噬水平的變化，探討自噬在星形膠質細胞缺血性損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要材料 出生3 d內的C57BL/6小鼠12只，購自北京維通利華實驗動物有限公司。LC3抗體購自Sigma-Aldrich公司。GFAP抗體、GAPDH抗體、Caspase-3抗體購自Proteintech公司。自噬抑制劑3-MA購自美國Sigma公司。乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒購自南京碧云天生物科技有限公司。CCK-8細胞活力檢測試劑盒購自南京恩晶生物科技有限公司。TNF-α檢測試劑盒購自南京金益柏生物科技有限公司。

1.2 小鼠星形膠質細胞分離 取出生3 d的C57BL/6小鼠，麻醉并處死小鼠，分離腦組織，加入DMEM洗滌3次，將血管和腦膜組織剔除，去大腦皮質，剪碎，在組織中加入0.25%胰蛋白酶，37 ℃孵育8 min，150目篩網過濾。加入DMEM洗滌，1 500 r/min離心5 min。添加含有青霉素-鏈霉素的DMEM培養液(含有10%胎牛血清)，接種到多聚賴氨酸(PLL)包被的T25細胞培養瓶中。放入細胞培養箱中孵育3 d，換液，待細胞長滿后，在37 ℃、220 r/min條件下振蕩孵育18 h，將小膠質細胞和神經元去除，用0.25%胰蛋白酶將貼壁細胞消化，接種到24孔細胞培養板中。

1.3 OGD/R對小鼠星形膠質細胞活化、存活率、損傷、凋亡、自噬的影響觀察

1.3.1 細胞分組及OGD/R處理 將星形膠質細胞接種到24孔板中，將細胞分為對照組和OGD/R組。對照組不做特殊處理。OGD/R組建立OGD/R模型：吸去正常培養基，用PBS清洗細胞2次，加入無糖DMEM培養基，將24孔板放入厭氧罐中，于37 ℃細胞培養箱中培養，分別于3、6、12 h后換成正常培養基，繼續在37 ℃細胞培養箱中培養12 h。

1.3.2 活化標志物檢測 采用Western blotting法檢測星形膠質細胞活化標志物膠質纖維酸性蛋白(GFAP)。將兩組細胞加入細胞裂解液在冰上提取總蛋白。4 ℃、12 000 r/min離心20 min。用BCA法進行蛋白定量。SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕轉法將蛋白轉印至PVDF膜上。用TBST洗滌PVDF膜3次，每次15 min。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。加入一抗(GFAP，1∶2 000)，4 ℃過夜。用TBST洗3次，每次15 min。加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔或羊抗鼠IgG二抗(1∶2 000),室溫孵育2 h。用TBST洗3次，每次15 min。用化學發光顯色法顯影。以目的蛋白灰度值與內參GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

1.3.3 細胞存活率測算 采用CCK-8法。將兩組細胞接種到96孔板中，在每個孔內加入10 μL的CCK-8溶液，放入培養箱中繼續培養4 h。酶標儀測定在450 nm處的吸光度值(A值)。細胞存活率=(OGD/R組A值/對照組A值)×100%。

1.3.4 LDH漏出率及TNF-α檢測 向細胞培養板中加入LDH釋放試劑，400 r/min離心5 min，取各組上清液120 μL，加入到新的96孔板中；各孔分別加入60 μL的LDH檢測工作液，混勻，室溫避光孵育30 min；測量490 nm處的A值；LDH漏出率=(實驗組A值-對照組A值)/(細胞最大酶活性A值-對照組A值)×100%。采用ELISA法檢測兩組細胞培養液中的TNF-α。

1.3.5 凋亡蛋白檢測 采用Western blotting法檢測凋亡相關蛋白Caspase-3。方法參照“1.3.2”。

1.3.6 自噬相關蛋白檢測 采用Western blotting法檢測自噬相關蛋白LC3B-Ⅱ。方法參照“1.3.2”。

1.4 自噬對星形膠質細胞活化、存活率、損傷、凋亡的影響觀察 取出生3 d的C57BL/6小鼠，參照“1.2”方法分離星形膠質細胞，分為對照組、3-MA對照組、OGD/R組、OGD/R+3-MA組。對照組不做特殊處理。OGD/R組、OGD/R+3-MA組建立OGD/R模型(缺氧缺糖培養后6 h更換正常培養基)。3-MA對照組及OGD/R+3-MA組造模前加入1 mmol/L的3-MA[10]。參照前述方法檢測GFAP、細胞存活率、LDH漏出率、TNF-α水平、Caspase-3。

2 結果

2.1 OGD/R后星形膠質細胞活化、存活率、凋亡、自噬變化 OGD/R組不同處理時間細胞GFAP表達、LDH漏出率、TNF-α水平均高于對照組，細胞存活率低于對照組(P均<0.05)；OGD/R組6 h、12 h時的Caspase-3/Pro-Caspase-3及LC3B-Ⅱ表達高于對照組(P均<0.05)。詳見表1。

表1 兩組細胞GFAP表達、細胞存活率、LDH漏出率、TNF-α水平、Caspase-3及LC3B-Ⅱ表達比較

注：與對照組比較，*P<0.01。

2.2 自噬抑制的星形膠質細胞活化、存活率、凋亡情況變化 OGD/R組細胞GFAP表達、LDH漏出率、TNF-α水平、Caspase-3/Pro-Caspase-3表達均高于對照組，細胞存活率低于對照組(P均<0.05)。OGD/R+3-MA組細胞GFAP表達、LDH漏出率、TNF-α水平、Caspase-3/Pro-Caspase-3表達均低于OGD/R組，細胞存活率高于OGD/R組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組細胞GFAP表達、細胞存活率、LDH漏出率、TNF-α水平、Caspase-3表達比較

注：與對照組比較，*P<0.01;與OGD/R+3-MA組比較，#P<0.01。

3 討論

腦卒中可影響各種腦功能區，涉及復雜的損傷反應[11]。腦缺血通過多種機制誘導神經損傷，包括神經興奮毒性、線粒體反應、自由基釋放、蛋白質錯誤折疊和炎癥改變[12]。星形膠質細胞的損傷和凋亡以及白質損傷也會導致腦損傷。星形膠質細胞是營養支持神經元，同時星形膠質細胞的終足與周圍毛細血管壁連接，參與血腦屏障維持。故而星形膠質細胞在腦卒中的損傷與恢復中發揮重要作用[13～15]。我們采用體外培養的原代小鼠星形膠質細胞制作OGD/R模型模擬體內腦卒中損傷，觀察了OGD/R后星形膠質細胞活化、凋亡、自噬的變化，結果顯示，OGD/R組不同處理時間細胞GFAP表達、LDH漏出率、TNF-α水平均高于對照組，細胞存活率低于對照組；OGD/R組中6 h、12 h亞組Caspase-3/Pro-Caspase-3及LC3B-Ⅱ表達高于對照組。這表明星形膠質細胞OGD/R后活化且自噬水平升高，同時細胞分泌TNF-α水平增加，LDH漏出率增加，細胞凋亡增多。TNF-α可以激活凋亡受體，促進細胞凋亡。生理狀態下LDH位于細胞內，在外界刺激下，LDH分泌到細胞外。TNF-α和LDH漏出率增加，表明星形膠質細胞活化促進缺血缺氧條件下星形膠質細胞的損傷。

大量研究表明，缺血刺激后腦組織中自噬被激活，但是自噬在腦缺血中的作用及影響尚未達成共識。目前普遍認為腦卒中后自噬激活具有雙向作用，一方面具有神經保護作用，可以保護細胞免受缺血損傷；另一方面也會促進缺血后神經元和星形膠質細胞凋亡[16,17]。自噬過度活化會導致細胞“自噬性死亡”[18]。本研究發現，OGD/R后星形膠質細胞中的LC3B-Ⅱ蛋白表達增加，表明自噬被激活，同時凋亡相關蛋白Caspase-3表達水平也顯著升高，表明OGD/R誘導星形膠質細胞自噬激活的同時也伴隨著凋亡的發生。研究表明，自噬和凋亡雖然是不同的機制，但有一些常見的信號分子共同參與其中，如AMPK、p62等[19]。有學者在大鼠tMCAO模型中使用RNAi方法抑制自噬的同時也抑制凋亡的發生，改善了tMCAO大鼠的預后[20]。這表明“自噬性細胞死亡”可能通過凋亡途徑介導細胞損傷作用，因此推測在缺糖缺氧條件下,星形膠質細胞內自噬激活可能通過促進凋亡加重星形膠質細胞的損傷。本研究進一步觀察了自噬抑制的星形膠質細胞活化、存活率、凋亡情況，結果顯示，OGD/R+3-MA組細胞GFAP表達、LDH漏出率、TNF-α水平、Caspase-3/Pro-Caspase-3表達均低于OGD/R組，細胞存活率高于OGD/R組。這提示抑制OGD/R星形膠質細胞自噬可以抑制凋亡的發生，減少TNF-α分泌，降低LDH漏出率，提高細胞存活率，抑制星形膠質細胞的活化，進一步說明抑制OGD/R后自噬的發生對星形膠質細胞具有保護作用。

綜上所述，OGD/R后星形膠質細胞活化增強，凋亡蛋白表達增加，自噬激活。自噬可能促進了星形膠質細胞的活化和凋亡，誘導星形膠質細胞缺血性損傷。上述研究結果對于理解星形膠質細胞自噬和凋亡的相關性有一定參考價值。雖然自噬參與了缺糖缺氧條件下星形膠質細胞的活化過程，并通過調節凋亡的進程影響星形膠質細胞的存活，但是由于自噬和凋亡調控機制的復雜性，許多相關調控因子在自噬和凋亡通路中的作用仍有待于進一步研究闡明。