超聲輔助基質分散液-液微萃取/氣相色譜-串聯質譜法測定水中48種半揮發性有機物

張 強，崔 君，顧 華，余肖峰，單曉鋒，朱 鴿

(1.國土資源部上海資源環境監督檢測中心，上海 200072；2.上海市地質勘查技術研究院，上海 200072)

苯胺類(Anilines，ANs)、硝基苯類(Nitrobenzenes，NBs)和鄰苯二甲酸酯類(Phthalates，PAEs)化合物常用于制備殺蟲劑農藥、醫藥中間體、染料和合成樹脂等[1-4]，并能從化工用品或生產廢水中遷移到水土環境中[5]，從而污染地表水及地下水。該3類化合物在水中具有極高的穩定性，可在環境中持續存在，且可在生物體內蓄積，對藻類、魚類和哺乳動物等具有毒害作用，有證據表明其對人體有致癌可能[6-12]。美國環保署(US EPA)規定飲用水中三硝基甲苯的最低限量為2 μg/L，2,4-二硝基苯和2,6-二硝基苯限量均為0.05 μg/L，并將2種苯胺類化合物列入水中129種優先控制污染物名單[13]；歐盟規定玩具和兒童護理用品中PAEs限量為0.1%[14]；我國《地表水環境質量標準》也對地表水中部分硝基苯類和苯胺類化合物的含量作出限定[15]。雖然國內研究者對水中硝基苯、苯胺和鄰苯二甲酸酯類化合物分類檢測多有研究，但同時測定15種硝基苯、19種苯胺和14種鄰苯二甲酸酯類化合物的研究甚少。

目前，水中硝基苯類和苯胺類物質的前處理方法主要為液-液萃取(LLE)[16]、固相萃取(SPE)[17-18]、固相微萃取(SPME)[19-20]、單液滴微萃取(SDME)[21]及頂空微萃取(HSME)[22]等。但液-液萃取耗時長，操作繁瑣，溶劑消耗量大；而微萃取則通過減少溶劑體積，提高萃取效率來克服上述問題。本研究充分發揮超聲輔助基質分散液-液微萃取(Ultrasound-assisted dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME)[24-28]操作簡單、快速，富集度高、溶劑損耗少等優點，探究并篩選出同時測定水質中48種常規檢測的半揮發性有機污染物的最優條件，并建立了簡單、快速和高靈敏度的測定方法，可為后續該類物質痕量水平的檢測提供借鑒和參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Trace ISQ單四極桿氣相色譜-質譜儀(美國Thermo-Fisher公司)；MinPlus型渦旋混合器(合肥艾本森科學儀器有限公司)；DS-2510DTH型超聲波清洗機(上海生析超聲儀器有限公司)；Hi-tech KFLOW型超純水機(上海和泰儀器有限公司)；TDZ4B-WS離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；10 μL進樣針(美國Thermo-Fisher公司)。

硝基苯類、苯胺類和鄰苯二甲酸酯類混合標準品(2 000 mg/L)；內標標準溶液：1,2-二氯苯-D4(500 mg/L)、菲-D10(200 mg/L)、鄰苯二甲酸二辛脂-D4和鄰苯二甲酸二丁酯-D4(1 000 mg/L)、苊-D10和萘-D8(1 000 mg/L)均購自上海安譜實驗科技股份有限公司；乙腈和甲醇(HPLC級，德國默克公司)；氯化鈉(分析純)，使用前于400 ℃灼燒4 h；氯苯、四氯化碳、1-十一醇和1-十二醇(優級純，上海國藥集團化學試劑有限公司)。實驗用水為去離子水。

1.2 溶液配制與樣品前處理

混合標準工作液：準確移取適量硝基苯類、苯胺類和鄰苯二甲酸酯類混合標準溶液用二氯甲烷配成質量濃度為100 mg/L的混合標準工作液?；旌蟽葮藰藴使ぷ饕海簻蚀_量取適量1,2-二氯苯-D4標準溶液、菲-D10標準溶液、鄰苯二甲酸二辛脂-D4和鄰苯二甲酸二丁酯-D4混合標準溶液、苊-D10和萘-D8混合標準溶液，用二氯甲烷配成質量濃度為50 mg/L的混合內標標準工作液，于4 ℃避光保存。標準曲線工作液：準確量取適量目標物標準工作液和混合內標標準工作液，用二氯甲烷稀釋配成質量濃度為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L的混合標準系列工作液，于4 ℃冰箱中避光保存。

樣品采集與保存：地下水取自上海不同地段地下水井，地表水取自上海不同地段河流水，采集后均充滿于棕色玻璃瓶，于4 ℃中避光保存。

樣品前處理：取10 mL水樣于10 mL尖底玻璃離心管中，分別加入2 g/L NaCl、10 μL 1 mg/L混合標準工作液和10 μL 1 mg/L混合內標標準工作液，迅速注入0.65 mL乙腈(分散劑)和40 μL四氯化碳(萃取劑)，輕搖離心管，使其混合至呈均勻的乳化渾濁狀，于40 ℃水浴中超聲2 min，再將其以3 500 r/min離心3 min，用10 μL進樣針在底部抽取1 μL注入GC-MS分析。

空白基質加標：取10 mL不含目標物的水樣，按照上述樣品前處理方法進行處理。

1.3 色譜-質譜條件

色譜柱：CD-5MS毛細管柱(30 m×2.5 mm×0.25 μm)，程序升溫：40 ℃保持1 min，10 ℃/min升至280 ℃，保持10 min。進樣口溫度260 ℃；載氣：氦氣(純度99.999%，液化空氣上海有限公司)；流速1 mL/min，不分流模式；電子轟擊(EI)離子源；離子源溫度：300 ℃；電子能量：70 eV；傳輸線溫度：280 ℃；進樣量：1 μL。掃描模式為選擇離子掃描(SIM)。

2 結果與討論

影響UA-DLLME萃取效率的因素主要有萃取劑和分散劑的類型和體積、萃取時間、萃取溫度及離子強度等。為獲得最佳實驗條件，本研究先采用Plackett-Burman設計篩選實驗變量，待確定顯著影響因素后，再通過中心復合設計(CCD)和響應曲面法研究各因素間的相互作用關系。

2.1 前處理條件優化

2.1.1 萃取溶劑的選擇在UA-DLLME過程中，選擇合適的萃取劑至關重要，一般需考慮揮發性低、熔點低、水溶性低且對目標化合物萃取效率高的溶劑。針對本研究所涉及的化合物，可選擇烷醇類(1-十一烷醇、1-十二烷醇、2-十二烷醇)、鹵代苯類(氯苯、溴苯、氟苯)、氯代烷烴類(CH2Cl2、CCl4、CHCl3)和離子液體4大類溶劑。由于對半揮發性有機物的萃取效率結論不一，且常用的幾類離子液體沸點較高，一般用于液相色譜分析。因此，本實驗考察了1-十一烷醇、1-十二烷醇、氯苯、CCl44種萃取劑對48種半揮發性有機物的萃取效率。結果顯示，1-十一烷醇和1-十二烷醇對鄰苯二甲酸酯類化合物萃取效率較高，但對其他2類物質萃取率低；氯苯和CCl4的萃取率相當，但鑒于氯苯的生物毒性較大，故選擇CCl4為萃取劑。

2.1.2 分散劑的選擇在DLLME過程中，分散劑的加入是一個必不可少的步驟，其用量過少會導致萃取劑在水相中與分析物接觸不完全，富集效率低；用量過多又會導致水相的極性降低，使被分析物在水相中的溶解度增大，也會降低富集效率。本研究的幾類物質常用的分散劑為甲醇和乙腈，通過實驗發現，乙腈的乳化效果最明顯，萃取效率最高，因此選擇乙腈為分散劑。

2.1.3 萃取劑體積、分散劑體積、萃取溫度、萃取時間及離子強度的影響在影響因素較多的情況下，通過Plackett-Burman實驗設計，每個因素設置高低2個水平，共12次隨機運行的總體設計矩陣，以消除外來或未知變量帶來的影響，確定主要影響因素。根據單因子實驗選擇萃取劑和分散劑后，確定至少有萃取劑體積、分散劑體積、萃取溫度、萃取時間和離子強度5個可能的主要影響因素。

由于同類物質的影響趨勢相同，因此選擇3-硝基苯胺、對-二硝基苯和鄰苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯分別代表苯胺類(NBs)、硝基苯類(ANs)及鄰苯二甲酸酯類(PAEs)進行評價(圖1)。 Pareto圖中的垂直線在判斷影響上具有統計意義；超出垂線表明，該因素在95%置信水平下具有顯著的統計學影響。結果顯示，分散劑體積、萃取劑體積和離子強度為硝基苯類物質的顯著影響因素；分散劑體積、萃取劑體積為鄰苯二甲酸酯和苯胺類物質的顯著影響因素。因此，綜合考慮選擇萃取劑體積、萃取溫度和離子強度為此3類物質的重要影響因素。其中萃取劑體積影響最為顯著；增加離子強度能促進分析物進入萃取劑中，提高萃取效率。萃取時間和分散劑體積為非顯著影響因素，這是因為UA-DLLME過程中，分散劑起促溶的作用，萃取劑和水相之間有無限大的接觸面，萃取能在短時間完成。

圖1 目標物的主要因素Pareto圖Fig.1 Pareto charts of the main effects for target compoundsA:disperser solvent volumes;B:extraction solvent volumes;C:ionic strength;D:extraction time;E:extraction temperature

基于Plackett-Burman設計篩選結果，將2個非顯著因素固定為萃取時間2 min、分散劑體積0.65 mL進行后續實驗優化。

2.1.4 中心組合設計-響應曲面法經Plackett-Burman實驗設計得到萃取劑體積、萃取溫度和離子強度3個顯著影響因素，再通過CCD實驗進一步驗證優化，并通過擬合二階多項式建立響應模型，公式如下：

式中，x1、x2和x3為3個獨立變量，β0為截距，β1～β33為回歸系數，y為響應強度。中心復合設計試驗次數常用表達式為：2f+2f+C。f為因子數，C為中心點數，本實驗因子數為3，中心點數為6，共設計20次實驗。

實驗結果與二階多項式方程的擬合值顯示出良好的一致性。相關系數R2>0.995，P<0.05，表明該模型顯著，精確度滿足實驗要求?；貧w模型用于分別計算每個變量的響應面。研究發現，隨著萃取劑體積在20～60 μL范圍內增加時，目標分析物的響應呈先增加后減小的趨勢，在萃取劑體積為40 μL時，響應最大，此時萃取效率最高(圖2)；在萃取溫度為40 ℃時考察萃取劑體積和離子強度(NaCl濃度)之間的關系，發現當離子強度從0.8 g/L升高到2 g/L時，目標分析物的響應變大，之后隨著離子強度升高反而降低(圖2A)，因此，設置離子強度為2 g/L；繼續考察萃取劑體積和萃取溫度間的關系(圖2B)，發現目標分析物的響應隨萃取溫度升高而增加，40 ℃后趨于穩定。

綜合考慮上述優化結果，選擇40 μL CCl4、0.65 mL乙腈、2 g/L NaCl、萃取溫度40 ℃、萃取2 min為最佳萃取條件。

圖2 3-硝基苯胺、對-二硝基苯和鄰苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯的響應曲面Fig.2 Response surfaces of 3-nitroaniline,p-dinitrobenzene and DEEPA1,A2 and A3:ionic strength vs extraction solvent volume of 3-nitroaniline,p-dinitrobenzene and DEEP;B1,B2 and B3:extraction temperature vs extraction solvent volume of 3-nitroaniline,p-dinitrobenzene and DEEP

2.2 色譜-質譜條件優化

48種目標物均為弱極性化合物，實驗比較了CD-5MS毛細管柱(30 m×2.5 mm×0.25 μm)和CD-1 MS毛細管柱(30 m×2.5 mm×0.25 μm)對目標物的分離效果，結果顯示：CD-1 MS色譜柱僅對硝基苯類化合物中少數物質的分離效果較好，而CD-5 MS色譜柱能有效分離此3類物質，因此選擇CD-5 MS色譜柱。由于鄰苯二甲酸酯類化合物的沸點較高，為縮短死時間，將進樣口溫度設置為260 ℃；為降低柱后殘留和離子源污染，實驗將柱溫箱最終溫度設置為280 ℃，離子源溫度設置為300 ℃。在“1.3”所述條件下，48種待目標物混合標準溶液(1.0 mg/L)的總離子流色譜圖見圖3，48種目標物分離效果好，背景干擾少。

圖3 48種目標物的標準GC-MS 總離子流圖Fig.3 TIC of GC-MS for 48 target compounds the number 1-48 were the same as those in Table 1

2.3 基質效應、線性關系及富集因子

基質效應(Matrix effect)是指樣品中除分析物以外的組分對分析過程產生的干擾，并影響分析結果的準確性，又分為基質增強和基質減弱效應。本研究通過對比同濃度不含待測物的空白水樣加入標準物質與純溶劑(二氯甲烷)配制標準溶液檢測信號強度，發現絕大部分目標分析物的基質效應計算值接近1，這是因為，實驗所研究的基質為河水和地下井水，較為干凈。因此，實驗采用二氯甲烷溶劑配制標準溶液繪制標準工作曲線，并計算方法的富集因子(Preconcentration factor，PF)，富集因子為萃取劑中分析物濃度(Csed)與水樣中分析物濃度(Co)之比，48種目標化合物的保留時間、選擇離子、線性方程、線性范圍、相關系數及富集因子見表1。結果顯示，48種目標化合物在1～200 μg/L質量濃度范圍內的線性良好，相關系數均大于0.995，富集因子為205～371。

表1 48種目標化合物的線性方程、線性范圍、相關系數和富集因子Table 1 Regression equations,linear ranges,correlation coefficients and preconcentration factors for the 48 target compounds

(續表1)

*quantitative ion

2.4 實際樣品分析及加標回收率

取上海不同地區的河水和井水，在優化條件下測定，并向其中添加低、中、高3個濃度的目標化合物進行加標回收實驗，每個濃度平行實驗6次，計算方法的回收率與相對標準偏差(RSD)，以3倍的空白信號標準偏差與標準曲線斜率的比值計算方法的檢出限(MDL)，并以4倍檢出限計算定量下限(LOQ)。結果顯示，48種目標化合物的MDL為0.001～0.030 μg/L，LOQ為0.004～0.120 μg/L；在3個加標水平下的回收率為77.4%～113%，RSD為2.0%～9.6%(表2)。地下水樣品的總流子流圖見圖4，由此可見，應用Plackett-Burman和CCD實驗設計通過DLLME方法所獲得的實際樣品中目標化合物的準確度和精密度結果令人滿意。

表2 48種半揮發性有機物的加標回收率、檢出限、定量下限及相對標準偏差(n=6)Table 2 Recoveries,MDLs,LOQs and relative standard deviations of 48 semivolatile organic compounds(n=6)

(續表2)

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圖4 地下水加標的GC-MS 總離子流圖Fig.4 TIC of GC-MS for spiked well water the peak number 1-48 were the same as those in Table 1

3 結 論

本研究建立了超聲輔助基質分散液-液微萃取/GC-MS同時測定地表水和地下水中48種半揮發性有機物的分析方法，前處理優化采用Plackett-Burman和CCD實驗設計，大大減少了試驗次數和溶劑用量。結果表明，48種目標物的LOQ為0.004～0.120 μg/L，回收率為77.4%～113%，RSD不高于9.6%。該方法具有簡單、快速等優點，對地表水和地下水中48種半揮發性有機物的痕量分析具有參考意義。