大黃魚魚卵磷脂-酪蛋白復合體系制備及固態基料開發

陸曉丹，鐘榕斌，黃璐瑤，魏 微，陳麗嬌，程文健，黃 群，梁 鵬，2

（1.福建農林大學食品科學學院，福建福州 350002；2.福建省海洋生物技術重點實驗室，福建福州 350002）

大黃魚（Pseudosciaena crocea） 作為我國重要的養殖經濟魚類之一，其主要生產繁殖基地位于福建寧德地區。根據《中國漁業統計年鑒》 （2019），大黃魚海水養殖全國產量達19.80萬t，其中16.54萬t產自福建省，占比高達83.54%[1]。大黃魚的主要加工副產物魚卵常常被當作廢棄物丟棄，造成污染環境和資源浪費的問題[2-4]。課題組前期發現，大黃魚魚卵中磷脂含量豐富，是ω-3多不飽和脂肪酸（PUFAs） 的重要來源，二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA） 占魚卵中總脂肪的比例之和達25.5%[5]，能有效預防高血脂癥等老年疾病，且DHA對大腦的發育也起著至關重要的作用[6-9]。大黃魚魚卵磷脂因富含ω-3 PUFAs而穩定性低，且略帶腥味，使其在食品工業中的應用受到了很大程度的限制[10]。

大黃魚魚卵磷脂具有多種生理功能，是一類含磷酸的脂類[11]，由1個極性磷酸頭部基團和1個或2個非極性脂肪?；膊炕鶊F構成[12]，因而具有優越的乳化性能。酪蛋白是牛奶中含量較高的優質蛋白質，其含有人體必需氨基酸，營養價值豐富。Beekwith A C[13]證實了磷脂-蛋白相互作用的存在；Van N W等人[14]認為磷脂與蛋白之間相互作用能達到協同促進乳液穩定的效果；Kasinos P M[15]也發現磷脂與牛奶中的蛋白質可以通過疏水相互作用力提高復合乳化體系的穩定性。噴霧干燥是目前食品工業應用最廣泛的微膠囊化方法之一，可將液態的復合乳液進一步固化得到方便存儲、運輸、食用的粉末狀產品，技術成熟，操作便捷[16-17]。

目前，關于植物磷脂的乳化性研究頗多，如大豆磷脂[18-19]、油菜磷脂[20]等，但是對大黃魚魚卵磷脂作為乳化劑與蛋白質復合的相關研究還未見報道。因此，為進一步提高大黃魚魚卵磷脂的綜合開發利用水平，在單因素試驗基礎上，借助Design Expert 8.0.6軟件進行響應面分析，優化大黃魚魚卵磷脂-酪蛋白復合體系的制備工藝條件，以期改善復合體系的乳化活性；還通過低溫噴霧干燥獲得大黃魚魚卵磷脂-酪蛋白固態基料，并對感官等理化指標進行表征，借助掃描電子顯微鏡研究固態基料的微觀結構，旨在豐富大黃魚魚卵磷脂的應用形式，為其應用于食品工業中提供理論依據，拓展大黃魚加工副產物的利用途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大黃魚魚卵磷脂，實驗室自制；酪蛋白，分析純，購自中國國藥試劑網；花生油，購自永輝超市。

WFZUV-2000型紫外-可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司產品；FB-110型高壓均質機，勵途（上海） 機械設備工程有限公司產品；BS110S型賽多利斯電子天平，賽多利斯（北京）天平有限公司產品；DHG-9070A型恒溫鼓風干燥箱，精宏（上海）實驗設備有限公司產品；LUMiSizer65型全功能穩定性分析儀，德國LUM公司產品；Nova NanoSEM 230型掃描電子顯微鏡，捷克FEI Czech Republic s.r.o.公司產品；HJ-4A型磁力攪拌器，金壇宏華（江蘇）儀器廠產品；YC-2000型低溫噴霧干燥機，雅程（上海）儀器設備有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 大黃魚魚卵磷脂-酪蛋白復合乳液的制備

參照王歡等人[21]的研究方法并稍作修改。首先，精確稱取2.0 g魚卵磷脂和4.0 g酪蛋白，分別置于80 mL和160 mL的磷酸鹽緩沖液中，得到大黃魚魚卵磷脂溶液和酪蛋白溶液；其次，按照單因素試驗方案既定的體積比例進行復配，加入適量的花生油和磷酸鹽緩沖液，共配制60 mL大黃魚魚卵磷脂-酪蛋白乳液；最后利用磁力攪拌器將復合乳液攪拌6 h，均質6次后，用于乳化活性指數和澄清指數測定。

1.2.2 單因素試驗

攪拌時間固定為6 h，均質次數為6次。

（1） 體積比的確定。均質壓力為500 bar，油相體積為4 mL，大黃魚魚卵磷脂溶液與酪蛋白溶液的體積比分別設定為1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5（V/V），比較不同復合體積比下復合體系的乳化活性指數和澄清指數。

（2）均質壓力的確定。選擇大黃魚魚卵磷脂與酪蛋白的最優體積比（1∶2），油相體積4 mL，均質壓力分別設定為300，400，500，600，700 bar，比較不同均質壓力下復合體系的乳化活性指數和澄清指數。

（3）油相體積的確定。選擇大黃魚魚卵磷脂與酪蛋白的最優體積比（1∶2） 和最優均質壓力（600 bar），油相體積分別設定為2，3，4，5，6 mL，比較不同油相體積下復合體系的乳化活性指數和澄清指數。

1.2.3 澄清指數測定

打開機器預熱30 min，調整溫度25℃，轉速3 000 r/min，使用移液槍取適量均質后的復合乳液加入測量管中，測試得到澄清指數圖表。

1.2.4 乳化活性指數測定

參考Molina E等人[22]的方法測定乳化活性。將均質完成的待測樣品使用預先配置好的0.1%SDS溶液稀釋至250倍，倒入比色皿中，紫外-可見分光光度儀經過預熱30 min后，調節波長為500 nm，測量獲得復合乳液樣品的吸光度。計算乳化活性指數（EAI）：

EAI=2×2.303×A×N×C-1×φ-1×10 000-1.

式中：N——稀釋倍數；

C——乳液形成前蛋白質質量濃度，g/mL；

φ——復合乳化液中油相體積分數，%；

A——乳液0 min時的吸光度。

1.2.5 噴霧干燥

將經過響應面優化后得到的大黃魚魚卵磷脂-酪蛋白復合體系，設置好參數（進風溫度80℃，壓力0.3 MPa，通針間隔時長8 s，蠕動泵流速15 g/min），將乳液加入噴霧干燥機中，得到大黃魚魚卵磷脂-酪蛋白固態基料。收集噴霧干燥后的固態基料，密封避光儲存，用于后續的試驗。

1.2.6 固態基料產品感官評定

（1）評價粉末產品的氣味，對粉末產品的色澤及組織狀態進行觀察。

（2） 將粉末產品進行沖調（按照比例10 g/100 mL 55℃熱水），評析其風味、口感及沖調性；

（3）將復原溶液靜置24 h，分析其復水穩定性。

1.2.7 固態基料水分測定

將樣品（2.5 g）置于烘箱中（溫度105℃），直接干燥至恒質量。水分含量按照以下公式計算：

式中：m1——烘干前的樣品質量，g；

m2——烘干后的樣品質量，g。

1.2.8 固態基料休止角測定[23]

將固態基料通過一漏斗倒落在圓盤中心，待粉末呈錐體狀并溢出圓盤邊緣時停止注入。休止角即粉末錐狀體與水平面所構成的夾角：

式中：H——錐體的高度，cm；

h——圓盤的高度，cm；

d——培養皿的直徑，cm。

1.2.9 固態基料堆積密度測定[24]

將固態基料注入量器中，壓實至刻度線并記錄所需的固態基料質量（m） 及體積（V），固態基料堆積密度按照以下公式計算：

式中：m——樣品的質量，g；

V——填充的體積，cm3。

1.2.10 固態基料溶解度測定[25]

將樣品（2.5 g）置于燒杯中并加入蒸餾水（50 mL，25～30 ℃） 溶解，離心 （10 min，4 500 r/min） 2～3次獲得沉淀物。將沉淀物移入恒質量稱量瓶（m1），再于烘箱烘干至恒質量（m2），溫度設置為105℃，溶解度通過以下公式計算：

式中：m——樣品質量，g；

m1——稱量瓶的質量，g；

m2——稱量瓶與不溶物的質量，g；

B——樣品的水分含量，%。

1.2.11 固態基料過氧化值的測定

參考GB 5009.227—2016測定固態基料的過氧化值。

1.2.12 固態基料的表面形態及微觀結構

將少量樣品均勻地撒在進樣臺的膠面上，拂去表面多余的粉末。真空噴金后，用掃描電鏡（SEM）觀察樣品的表面形態及內部微觀結構，調整合適的視野拍照并保存，設置加速電壓為20 eV。

1.2.13 數據分析與處理

使用Design Expert 8.0.6軟件進行響應面優化設計及結果分析，采用Origin Pro 9.1軟件進行數據統計、分析與制圖。

2 結果與分析

2.1 大黃魚魚卵磷脂-酪蛋白復合溶液的制備

2.1.1 體積比的確定

澄清指數可以反映復合乳液的穩定性，乳化活性指數是反映乳液乳化性質的重要指標。另外，對乳化活性和澄清指數的測定包括空白對照組、5組試驗組，并對6組進行3次平行測定，最后取平均值。

大黃魚魚卵磷脂與酪蛋白體積比對乳化活性和澄清指數的影響見圖1。

由圖1可以看出，隨著酪蛋白含量增加至體積比為1∶2，大黃魚魚卵磷脂-酪蛋白復合體系的乳化活性指數隨著酪蛋白含量的增多而升高；當體積比為1∶2時，乳化活性指數達到最大平均值49.47 m2/g，體積比由1∶3變化至1∶5，乳化活性指數隨著酪蛋白含量的增多而降低。與此同時，隨著酪蛋白所占比例的增加，復合體系的澄清指數呈現先減小后增大的趨勢，在體積比為1∶2時，澄清指數下降到最小平均值0.031?？赡苁怯捎诖簏S魚魚卵磷脂與酪蛋白通過疏水作用力結合，磷脂的量不變，當酪蛋白含量增大到一定程度時，磷脂的疏水性磷脂尾部基團所能包裹的疏水性蛋白區域達到極限[26]，說明大黃魚魚卵磷脂與酪蛋白的混合已達飽和狀態，磷脂的乳化性能趨于穩定。試驗結果與王歡等人[21]保持一致，當磷脂與蛋白體積比為1∶2時，大黃魚魚卵磷脂-酪蛋白復合體系的乳化活性指數較之更高，說明大黃魚魚卵磷脂的乳化能力較大豆磷脂更優。因此，取大黃魚魚卵磷脂與酪蛋白體積比為1∶2作為后續試驗操作參數。

2.1.2 均質壓力的確定

均質壓力對乳化活性和澄清指數的影響見圖2。

由圖2可以看出，隨著均質壓力的增大，大黃魚魚卵磷脂-酪蛋白復合體系的乳化活性指數呈現先增大后減小的趨勢，當壓力達600 bar時，乳化活性指數達到最大平均值49.56 m2/g，逐漸增大均質壓力使得蛋白分子結構逐漸變得松散，因而酪蛋白會暴露出更多的疏水基團，這些基團與磷脂的疏水尾部相互作用得到增強[27]，復合體系的親水親油程度同時增加，復合程度達到最大。進一步增大均質壓力，乳化活性指數降低，可能是由于蛋白質-蛋白質分子間的疏水作用開始產生[28]，酪蛋白與大黃魚魚卵磷脂的作用受到競爭性抑制作用而減弱，乳化活性便開始降低。隨著均質壓力的增高，大黃魚魚卵磷脂-酪蛋白復合體系的澄清指數呈現先減小后增大的趨勢，當壓力達到600 bar時，澄清指數出現最小平均值0.031，說明大黃魚魚卵磷脂和酪蛋白在均質壓力600 bar下復合效果最優。因此，選擇均質壓力600 bar進行后續單因素試驗。

2.1.3 油相體積的確定

油相體積對乳化活性和澄清指數的影響見圖3。

由圖3可以看出，隨著油相體積的增加，大黃魚魚卵磷脂-酪蛋白復合體系的乳化活性指數逐漸增大，當油相體積等于5 mL時，乳化活性指數上升至最大平均值49.32 m2/g，繼續增加油相體積，乳化活性指數又呈下降趨勢。這是由于油相體積的增加使得磷脂和蛋白分子的親油基團與油相連接更加緊密，降低復合體系油-水界面的表面張力，體系穩定性達到最大且趨于穩定，再增加油相時反而會破壞油-水界面平衡。隨著油相體積的增加，復合體系的澄清指數呈現逐漸減小的趨勢，當油相體積為5 mL時，澄清指數平均值減至最小0.034，油相體積增加至6 mL時，澄清指數略有增大。因此，取油相體積5 mL作為后續試驗操作參數。

單因素試驗結果顯示，大黃魚魚卵磷脂和酪蛋白體積比、均質壓力和油相體積對復合體系的澄清指數有影響，但變化幅度不大；故以乳化活性指數為響應值，選擇大黃魚魚卵磷脂與酪蛋白體積比為1∶2，均質壓力600 bar，油相體積5 mL為自變量進行后續響應面優化試驗。

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 響應面試驗設計與結果

利用Box-behnken試驗設計對單因素試驗進行優化分析，以大黃魚魚卵磷脂和酪蛋白復合比例、均質壓力和油相體積為自變量，以乳化活性指數為響應值，利用響應面法對大黃魚魚卵磷脂-酪蛋白復合體系制備工藝進行優化。

Box-behnken試驗設計因素與水平設計見表1，響應面試驗設計及結果見表2。

表1 Box-behnken試驗設計因素與水平設計

表2 響應面試驗設計及結果

2.2.2 響應面試驗結果分析

使用Design Expert 8.0.6軟件對響應面法試驗數據進行分析，得到關于大黃魚魚卵磷脂與酪蛋白體積比（A）、均質壓力（B） 和油相體積（C） 的二次多項回歸方程：

對該模型的顯著性檢驗和方差進行分析。

回歸模型方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析

由表3可以看出，p＜0.000 1，說明試驗所選回歸模型極顯著。失擬項p值為0.057 7（p＞0.05），表明未知因素對模型的試驗結果干擾較小，可以用此模型分析和預測魚卵磷脂-酪蛋白復合乳液體系的穩定性。該模型的一次項B、C和二次項A2，B2，C2極顯著 （p＜0.01），交互項 AB 顯著 （p＜0.05），通過方差分析得到回歸模型的決定系數R2=0.982 3，R2的值越接近1，描述試驗結果的準確度越高。試驗的變異系數C.V.%=2.2＜10，其數值越小表明該試驗的可靠性越高。從Adeq Precision=20.183＞4可以看出，模型的響應信號足以擬合試驗的結果。

2.2.3 優化試驗的結果驗證

經響應面試驗得出磷脂與蛋白的體積比、均質壓力、油相體積對大黃魚魚卵磷脂-酪蛋白復合體系穩定性的影響顯著。選出最佳的工藝條件為大黃魚魚卵磷脂與酪蛋白復合比例為0.56，均質壓力為575.74 bar，油相體積為6 mL，在此條件下乳化活性指數的預測值為49.92 m2/g。為便于操作，將響應面模型所得優化條件修整為大黃魚魚卵磷脂與酪蛋白體積比為1∶2，均質壓力為600 bar，油相體積為6 mL；用該工藝條件重復進行3次試驗驗證優化結果，實際測得的乳化活性指數的平均值為49.49 m2/g，實際測量值與響應面預測值的相對誤差為0.87%，說明經優化后得到的工藝參數具有一定的參考價值。

2.3 固態基料的感官狀態及復水穩定性評價

參考中國水產行業標準SC/T 3505—2006可知，固態基料的品質受水分、氧化程度和結構等多個因素的影響；水產固態基料應為微魚腥味、無酸敗味、色澤均勻的粉末狀產品；水分含量應小于或等于5%，過氧化值應小于或等于6 mmol/kg，表面光滑、致密且無裂紋，形態呈球狀。

實驗室制備的大黃魚魚卵磷脂-酪蛋白固態基料見圖4。

對固態基料產品（圖4）及用60℃熱水沖調的的樣品進行感官評定。

感官評定結果分析見表4。

表4 感官評定結果分析

使用溫度為60℃的水沖調固態基料樣品，進行復水穩定性評定。

復水溶液的狀態見圖5。

固態基料樣品沖泡時能在較短時間內溶解，表明其具備良好的溶解性。圖5（a） 為固態基料沖調后的狀態，為白色均勻液體，顆粒細小無絮片，表面無分層。由圖5（b） 可知，復水溶液經放置24 h后，無沉淀及分層現象，品質幾乎未受影響，可進一步加工應用于食品工業中。

2.4 固態基料的理化性質

大黃魚魚卵磷脂-酪蛋白固態基料的基本理化指標見表5。

表5 大黃魚魚卵磷脂-酪蛋白固態基料的基本理化指標

由表5可知，所得固態基料產品的水分含量低，僅為1.3%，固態基料的過氧化值為1.65 mmol/kg，明顯低于中國水產行業標準SC/T 3505—2006規定的過氧化值，符合水產行業標準。氧化程度和水分含量均會影響固態基料的貯藏穩定性。干燥產品在儲存期間水分含量為3%～4%，其具有良好的穩定性[29]；休止角越小，流動性能越好[30]。固態基料產品休止角為33.57°，說明粉體的黏性越小，具有良好的流動性。

2.5 粉末的微觀結構

通過掃描電鏡，可以觀察到在最佳條件下（乳化活性指數為49.49 m2/g），經噴霧干燥制備的固態基料產品的表面形態。

固態基料的掃描電鏡圖見圖6。

由圖6可知，最佳條件下制備的固態基料多數為近球狀，表面粗糙但無嚴重黏連現象，粒徑介于5～30 μm。表面的褶皺與凹痕是噴霧干燥法制備粉末產品的普遍特征[31]。噴霧干燥機在實際運轉過程中，其進氣量達不到恒穩的狀態，水分蒸發過程中速率不同產生不均勻收縮，導致固態基料產品的變形[32-33]；另外，掃描加壓也使固態基料表面凹陷[34]，使得固態基料的大小和形態差異較大。經噴霧干燥制得的固態基料產品結構完整、表面致密無裂縫、略有凹陷，可有效隔絕氧氣和濕度等外界不良因素的影響。

3 結論

以乳化活性指數為指標，在單因素試驗基礎上進行響應面優化分析，得出大黃魚魚卵磷脂-酪蛋白復合體系的最優配置參數為大黃魚魚卵磷脂與酪蛋白體積比1∶2（mL/mL），均質壓力600 bar，油相體積6 mL。最佳條件下制備的固態基料產品具有良好的感官特性，氣味協調無異味、顆粒細小、分散均勻、溶解性及水復溶性良好；結構致密完整，表面略有凹陷，無孔隙裂縫，粉末多為近球形，粒徑介于5～20 μm，試驗結果為大黃魚加工副產物的高值化綜合利用提供了前期理論基礎。

但試驗未能對該復合體系進行乳化穩定性的研究，乳液乳層析指數是表征乳液中油相和水相之間所達到的平衡穩定性的重要指標，可客觀反映乳液的儲存穩定性，后續可通過測定乳層析指數判斷乳液的分層情況。也可在后續試驗中對固態基料的營養價值及氧化貯藏穩定性進行探討。