谷 瑤,李桂珍,溫如斯,楊 漓
(廣西壯族自治區林業科學研究院,廣西南寧 530002)
竹醋液是竹材熱解得到的液體產物,是一種組成成分相當復雜的深紅褐色液體混合物,其主要成分是水、有機酸、酚類、酮類、醇類等物質,pH值2.20~3.01,相對密度1.02左右,其成分隨著竹種、生產條件、收集方法、加工處理工藝、包裝、貯存運輸條件等的不同而不斷變化[1-3]。竹醋液在食品、醫藥、化工、農業、環保等領域有著非常廣泛的應用[4-6]。在食品加工方面,竹醋液主要用于熏制火腿和香腸,也可用作熏煙味的食品添加劑。竹醋液具有較強的熏香感和醋酸味,具有魚肉、保鮮、防止油脂、維A被氧化,防腐、殺菌的作用。但是,竹醋液含有大量的酚類物質,特有的竹焦油和醋酸影響了食品的風味,對食品安全也帶來一定影響。試驗旨在為竹醋液更好地應用于食品加工領域、減少化學殺菌劑的使用量,以及為研制低毒殺菌制劑提供理論依據。
竹醋液原液、精制竹醋,桂林綠竹有限公司提供;厚樸、黃連、苦參、蛇床子、菖蒲及獨活,南寧萬藥堂藥業有限公司提供;中和劑選擇為含0.5%卵磷脂+0.5%組氨酸+1.0%吐溫-80的PBS溶液,上海酶聯生物科技有限公司提供;大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、白色念珠菌(C.albicans)、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa) 第7~9代,中國科學院微生物菌種保藏中心提供;小白鼠、白色家兔,廣西醫科大學實驗動物中心提供;白色豚鼠,昆明醫科大學實驗動物中心提供;其他材料及試劑,南寧市藍天試驗器材有限公司提供。
HH·B11·600-S-Ⅱ型電熱恒溫培養箱,上海龍躍儀器設備有限公司產品;LRH-250A型生化培養箱,韶關市泰宏醫療器械有限公司產品;JY10001型電子天平,上海雙旭電子有限公司產品;HNW-S-6型電熱恒溫水浴箱,上海汗諾儀器有限公司產品。
1.3.1 中藥的提取
厚樸、黃連、苦參、蛇床子、菖蒲及獨活經烘干(60℃,8 h)粉碎后,分別稱取50 g溶于200 mL純化水中,微沸浸提1 h后,過濾收集濾液,抽真空狀態下旋轉蒸發并濃縮到50 g。
1.3.2 菌懸液的制備
細菌在細菌培養基斜面上于37℃下活化24 h,白色念珠菌在沙氏培養基斜面上于30℃下活化48 h,備用。將活化后的菌種用生理鹽水配置成105~110個/mL(血球計數法)的菌懸液,備用。
1.3.3 抑菌作用的測定
取樣品于超凈工作臺中,用無菌水配成體積分數不同的稀釋液。取50 μL菌懸液(細菌為1×106個/mL,真菌為1×105個/mL) 鋪板,將濾紙片放至平板中央,加30 μL樣品,以水作為對照組。適溫培養(細菌于37℃下培養,白色念珠菌于28℃下培養),待對照長滿后,測量抑菌圈直徑。
1.3.4 殺菌作用的測定
每支試管加入2.5 mL配置好的樣品(培養基混合物),然后再加入0.5 mL菌懸液(細菌1×107個/mL、白色念珠菌1×107個/mL),充分振蕩后,搖床培養。培養條件為細菌溫度37℃,轉速150 r/min;白色念珠菌溫度28℃,轉速150 r/min,培養24 h;取50 μL菌液涂板,待對照組長滿板后,觀察結果。
1.3.5 生物形容性的測定
根據GB 15979—2002《消毒技術規范》Technical standard for disinfection(2002年版) 進行急性經口毒性、皮膚刺激、陰道黏膜刺激、皮膚變態反應等試驗。
1.3.6 精制竹醋與中藥提取物復配作用評價
將厚樸、黃連提取物與精制竹醋按照2∶1,1.5∶1,1∶1,1∶1.5,1∶2進行配比,制備精制竹醋與中藥提取物不同配比的復配制劑,根據1.3.4進行殺菌作用測定。
(1)增效作用計算方法。①以所混化學藥劑為標準藥劑,則:
A的相對毒力指數:
所用標準藥劑的相對毒力指數:
TlI=100.
組合物M的理論毒力指數:
組合物M的實際毒力指數:
②增效作用的評判標準。一般認為共毒系數CTC>120具增效作用,CTC=80~120為相加作用,CTC<80為拮抗作用。共毒系數采用孫云沛方法計算,CTC=(ATI/TTI)×100。CTC>120為增效作用,CTC=80~120為相加作用,CTC<80為拮抗作用[7-9]。
2種竹醋液理化性質對照見表1。
表1 2種竹醋液理化性質對照
竹醋液原液精制后能夠去除大部分竹焦油,精制后竹醋的折光率降低了5.9%,說明精制后去除了大量的大分子物質及雜質,可以更好地應用于食品加工領域。
2種竹醋液的抑菌效果比較見表2。
表2 2種竹醋液的抑菌效果比較
由表2可知,竹醋液原液對4種菌的抑制效果皆優于精制竹醋,并且2種竹醋液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果較為接近,這與常雅寧等人[10]通過竹醋液對食品污染菌的抗菌作用的研究結果相吻合。
2種竹醋液對供試菌的致死濃度見表3。
表2比較了竹醋液原液和精制竹醋對4種指示菌的致死濃度。由表3可知,質量分數為 25%及以上的竹醋液原液和精制竹醋可完全抑制4種受試菌的生長。此外,2種竹醋液對E.coli及S.aureus的最低殺菌質量分數均為5%,殺菌效果較為接近。而精制竹醋對P.aeruginosa的殺菌效果優于C.albicans,但對二者的最低殺菌質量分數均高于竹醋液原液。
表3 2種竹醋液對供試菌的致死濃度
中藥提取物的抑菌作用見表4。
表4 中藥提取物的抑菌作用
由表4可知,參照北京藥品檢驗所提供的常規抗生素藥敏抑菌圈標準,抑菌圈在21 mm以上,為抑菌能力強,以“+++”表示;在16~21 mm為抑菌能力較強,以“++”表示;15 mm以下為抑菌能力弱,以“+”表示;無抑菌圈出現為無抑菌作用,用“-”表示。中藥藥液的平均藥物質量濃度為7.5 mg/mL。由表3可知,厚樸及黃連對大腸桿菌的抑菌效果均優于其他中藥,同時,黃連對于白色念珠菌的抑制效果最佳。
選擇厚樸和黃連、苦參、蛇床子、菖蒲、獨活浸提物與精制竹醋按照1∶1質量比輔配,厚樸和黃連、苦參、蛇床子與精制竹醋具有增效作用,其中厚樸和黃連與精制竹醋具有明顯增效作用,菖蒲、獨活與精制竹醋沒有增效作用。
不同混合制劑對4種菌的抑制作用見表5。
由表5可知,同一配比,黃連與精制竹醋混劑的增效作用均高于厚樸與精制竹醋混劑,并且C∶A=1.5~2∶1時效果最佳。
表5 不同混合制劑對4種菌的抑制作用
表6 受試物對小鼠急性經口毒性試驗結果
2.5.1 急性經口毒性試驗
受試物對小鼠急性經口毒性試驗結果見表6。
混合制劑對小鼠的急性經口LD50大于5 000 mg/kg BW,根據消毒劑的急性評價規定,混合劑的急性經口毒性屬實際無毒級。
2.5.2 皮膚刺激試驗
受試物對家兔多次皮膚刺激性試驗結果見表7。
混合制劑對家兔多次皮膚刺激性試驗結果為無刺激性。
2.5.3 陰道黏膜刺激試驗
肉眼觀察染毒組和對照組各有2只家兔陰道黏膜可見輕微充血,染毒組有2只家兔陰道黏膜分別可見輕度和明顯的水腫,對照組未見水腫。病理檢查結果感染組的病例評分均值為7.33,對照組的評分均值為5.33,陰道黏膜刺激指數為0.33。
表7 受試物對家兔多次皮膚刺激性試驗結果
2.5.4 皮膚變態反應試驗
試驗組豚鼠在激發接觸混合劑后24,48 h均未見受試皮膚出現紅斑及水腫等刺激反應,皮膚致敏率為0;陽性對照組使用的陽性物為2.4-二硝基氯苯(致敏和激發質量濃度分別為10,8 mg/mL),致敏率為70%;陰性對照組豚鼠受試皮膚未見異常。結果表明,混合劑對豚鼠皮膚變態反應試驗結果為未見皮膚變態反應。
竹醋液原液精制后抑菌及殺菌效果皆減弱,厚樸、黃連提取物對大腸桿菌及白色念球珠菌的抑菌效果優于連翹、牡丹皮、菖蒲及獨活提取物;厚樸和黃連、苦參、蛇床子與精制竹醋具有增效作用,菖蒲、獨活與精制竹醋沒有增效作用;黃連與精制竹醋混合制劑對4種菌的抑制效果最佳,并且此混合制劑屬于實際無毒級,對家兔皮膚進行多次刺激都表現為無刺激性,對豚鼠皮膚無致變態反應作用,但對家兔陰道黏膜有極輕刺激性,體現良好的生物相容性。