海洋沉積物異養菌總數的測量不確定度評估

劉茜(譜尼測試集團上海有限公司，上海 200233)

0 引言

海洋微生物在海洋生態環境中具有極其重要作用，在全球生物地球化學過程以及生態環境的自然修復中，有著舉足輕重的地位。海洋沉積物中微生物組成復雜，不同海水區域，其微生物群落變化明顯。近代人類不可持續生產及生活方式，使海洋環境遭受嚴重污染。海水養殖業、工業污水排入、地表徑流及河流流入等，均給近海生態環境帶來影響。海洋沉積物異養菌總數在近岸污染生態基線(背景)調查和環境質量綜合評價中，也作為必檢項目給予監測[1]。

測量不確定度是與測量結果相關聯的參數，用以表征合理賦予被測量值的分散性。CNAS—CL07：2011《測量不確定度的要求》對檢測實驗室要求，實驗室應對每一項有數值要求的測量結果進行測量不確定度評估，尤其要求在開展新的檢測方法時，或在客戶有要求時，或用來確定是否符合某規范所依據的誤差限的寬窄時[2]。在目前關于微生物檢測不確定度的研究中，幾乎找不到關于海洋沉積物異養菌總數測量不確定度的相關報道。由于微生物在樣品中分布的不均勻性，及海洋沉積物微生物組成的復雜性，測量不確定度的研究顯得尤為重要。CNAS—CL09：2013《檢測和校準實驗室能力認可準則在微生物檢測領域的應用說明》要求在微生物檢測領域，某些情況下，一些檢測無法從計量學和統計學角度對測量不確定度進行有效而嚴格的評估，這時至少應通過分析方法，考慮它們對于檢測結果的重要性，列出各主要的不確定度分量，并做出合理的評估。有時在重復性和再現性數據的基礎上估算不確定度也是合適的[3]。本文參考各方資料，對海洋沉積物異養菌總數測量不確定度進行分析考察。

1 實驗部分

1.1 儀器設備

電子天平，型號JA21002，精度為0.1g，上海良平儀器儀表有限公司。

培養箱，型號MJX-250B-Z，上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

凈化工作臺，型號SW-CJ-1F，蘇州凈化設備有限公司。

立式壓力蒸汽滅菌器，型號YXQ-LS-100SII，上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

無菌培養皿，直徑90mm。無菌錐形瓶，容量250mL、500mL。微量移液器及無菌吸頭。

1.2 試劑與材料

2216E 培養基，購于青島海博生物技術有限公司。樣品，海洋沉積物底泥來源于上海市南匯。

1.3 操作步驟

樣品制備：取海洋沉積物底泥，取樣前盡可能混合均勻。

檢測步驟 ：操作參考GB 17378.7—2007 海洋監測規范 第7 部分：近海污染生態調查和生物監測 附錄F 的方法。無菌稱取1.0g 沉積物(底泥)樣品，然后加入9mL 無菌海水，混勻；無菌操作吸取混勻后的混合樣1mL，加入到盛有9mL 無菌陳海水的試管內混勻，并依同法依次連續稀釋至所需稀釋度。選擇2～3個適宜的稀釋度樣品勻液，吸取0.1mL 分別加入預先制備好的2216E 培養基平皿內，每個稀釋度接種三塊平皿。用滅菌不銹鋼涂布棒涂布均勻，平皿置于超凈工作臺靜置20～30min，待樣液滲入培養基后，將此平皿移入恒溫箱25℃培養7 天，取出計數平板上菌落[1]。

1.4 菌落計數與計算結果

選取菌落數在30～300 范圍內稀釋度的平皿進行菌落計數[1]。細菌總數為3 塊平板菌落數的平均值，再乘以稀釋倍數。出現其他計數情況，按標準中要求進行計數。

2 不確定度分析

2.1 不確定度的主要來源分析

微生物計數的測量不確定的評估一般采取整體法進行評估。以便控制結果來源的各個測試程序。整體法可看作是一個“黑匣子”系統[4]，對不確定度的主要來源均包含在其中，現對各來源進行分析，以確定對本測試有影響的重要分量。

2.1.1 取樣及次級取樣

從大量的待測樣品中取出測試單元的步驟，是總誤差的重要組成部分。但是該部分并不是測量本身不確定度的組成部分，因此在本分析中不予考慮。次級取樣是指從分析樣品中取出的測試部分，本測試中為初始懸液的制備。海洋沉積物中微生物種類豐富組成復雜，分布不均勻，個體差異較大，因此方案需考慮次級取樣的因素。

2.1.2 樣品的質量

樣品質量的不確定評定可通過不確定傳播的方式來獲得，即通過天平的不確定度。但是在微生物檢測中，樣品的質量因素對測量不確定度的貢獻較小，因此該因素一般不作為結果不確定度的主要來源。

2.1.3 微生物在樣品中的分布及數量

狀態一致的樣品會由于污染情況不同，而出現不同分布。試驗前的樣品應盡可能混勻，但是由于微生物間或微生物與設備間有相互吸引或相互排斥的傾向，導致樣品中的微生物過度離散，呈現隨機分布。按照統計學原理，其最終結果還是會呈現泊松分布?；谫Y料，一般不對低含量樣本的不確定度進行考察，因為當含量過低時，重復性和再現性很難測量，不確定度沒有簡單統一的方法來評定。

2.1.4 操作方式

分析過程中的一系列因素，如不同稀釋倍度結果的差異、同一稀釋度不同平板計數的差別、人員對平板菌落觀察結果計數的差別、檢測時間、設備培養溫度的差異及培養基等因素，是不確定度貢獻的主要來源。對于隨機誤差，可能來源于人員操作手法及設備的使用，在重復性條件下實驗室內部進行評定時可給予考慮。另外，因分析步驟直接決定測量結果，根據經驗本次實驗不考慮偏倚因素。

2.2 建立數學模型[5]

測量中，設被測量異養菌總數為Y，實驗結果為X，則Y=X。

2.3 實驗方法的確認與實施

本實驗方案為取不同濃度的沉積物基質樣品，每份樣品分為A、B 兩組不同實驗員。因微生物濃度在樣品基質中不穩定，會隨時間變化有所改變，所以本方案中無法考慮不同分析時間帶入的影響。為盡可能得到不同的A、B 情況、兩組人員采用不同滅菌批次的培養基試劑、不同的操作臺、不同的移液器、不同的培養箱，以覆蓋人員、培養基配制、設備溫度等因素所引起的操作條件的變化。

對樣品分別準備的10 組待測樣品，每組樣品重復測試2次。根據GB 17378.7—2007 進行菌落計數。

樣品不確定度計算：樣品10 組結果取對數，計算再現性標準差結果見表1。

表1 樣品再現性標準差的計算

式中：SR為再現性標準偏差；yij為對數轉換值(lg(CFU/mL))；n為給定基質樣品數量；i 為樣品的序號，i=1～n；j 為再現性條件的編號，j=A 或j=B。測試結果以Y=lgX 表示，再現性標準差以SR表示，在包含因子為2(置信水平95%)時，則擴展不確定度為：U=2SR=0.18

2.4 結果報告

每組樣品結果以區間的形式表示為lgXi-0.18≤lgXi≤lg+0.18，取反對數得到每一樣品微生物含量的區間。以第1 組測試樣品為例，lgX 的取值范圍為2.65≤lgX1A≤3.01，該測試樣品異養菌總數取對數值得到微生物含量X1A的所在區間為447≤X1A≤1023。

3 討論

本文依據GB 17378.7 平板計數表面涂抹法對海洋沉積物異養菌總數進行測定，依據JJF1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》、RB/T 151—2016《食品微生物定量檢測的測量不確定度評估指南》等資料，對測量結果不確定度進行分析，建立了海洋沉積物異養菌總數不確定度的評估方法。由于微生物數據的發散性較大，平板計數呈偏態分布，需要先將檢測結果取對數，轉化為正態分布后使用。由于x 和lgx 之間的非線性關系，計算得到的擴展不確定度U 不能直接換算到x，因此只能給出測定結果的可能區間。

4 結語

綜上所述，本文建立的不確定度評估方法，可為實驗室質量管理及評價提供科學依據。對于不確定度的主要來源文中已詳細介紹，在此不再贅述。實驗室在操作過程中，應關注各影響因素，一方面加強試劑耗材及關鍵性設備的質量驗收，另一方面提高檢測人員的操作技能，以降低隨機誤差。