苯甲酰芍藥苷增強ABCA1表達促進膽固醇流出

陳曉佳 唐菀澤 馬衛列 丁航 張志珍

[摘要] 目的 探討白芍醇提物苯甲酰芍藥苷（BP）對THP-1細胞膽固醇流出的影響。 方法 實驗分ac-LDL組、apoA-1組和apoA-1+BP組。THP-1細胞加入160 nmol/L佛波酯（PMA）24 h，再加入50 μg/mL乙?；兔芏戎鞍祝╝c-LDL）建立泡沫細胞模型。液體閃爍計數法測定泡沫細胞膽固醇流出率;酶化學反應檢測細胞總膽固醇濃度;定量PCR（qPCR）檢測三磷酸腺苷結合盒轉運體 A1（ABCA1）表達;Western blot分析ABCA1、固醇調節元件結合蛋白（SREBPs）、肝X受體α（LXRα）蛋白表達變化。 結果 成功建立THP-1泡沫細胞模型。apoA-1+BP組泡沫細胞膽固醇流出率高于apoA-1組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。apoA-1+BP組泡沫細胞內總膽固醇含量低于apoA-1組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。apoA-1+BP組泡沫細胞ABCA1 mRNA和蛋白表達量均高于apoA-1組，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。apoA-1+BP組泡沫細胞LXRα蛋白表達水平高于apoA-1組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。apoA-1+BP組 SREBP1、SREBP2蛋白表達量低于apoA-1 組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。 結論 BP可通過LXRα-ABCA1通路促進膽固醇流出。

[關鍵詞] 苯甲酰芍藥苷;膽固醇流出;泡沫細胞

[中圖分類號] R282;Q54 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）04（a）-0008-05

Benzoylpaeoniflorin promote cholesterol efflux by enhancing ABCA1 expression

CHEN Xiaojia1 ? TANG Wanze2 ? MA Weilie1 ? DING Hang1 ? ZHANG Zhizhen1

1.School of Basic Medicine， Guangdong Medical University， Guangdong Province， Dongguan ? 523808， China; 2.Department of Spine Surgery， Shenzhen People′s Hospital ?Shenzhen Institute for Orthopaedic Research， Guangdong Province， Shenzhen ? 518020， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Benzoylpaeoniflorin （BP） on cholesterol efflux from THP-1 cells. Methods The experiment was divided into ac-LDL group， apoA-1 group and apoA-1+BP group. The model of foam cells was established by adding 160 nmol/L phorbol-1-myristate-13-acetate （PMA） for 24 h in THP-1 cells， followed by 50 μg/mL acetylated low-density lipoprotein （ac-LDL）. The foam cells cholesterol efflux rate was determined using liquid scintillation counting， the contents of total cholesterol of foam cells were observed by enzymatic reaction method. adenosine triphosphate binding cassette transporter A1（ABCA1） mRNA expression was detected by quantitative polymerase chain reaction （qPCR）. The expression of ABCA1， sterol regulated original binding proteins（SREBPs）and Liver X receptor alpha （LXRα） were analyzed by Western blot. Results THP-1 cell model was successfully established. Cholesterol efflux of foam cells in apoA-1+BP group was higher than that in apoA-1 group， and the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. The total cholesterol content of foam cells in apoA-1+BP group were lower than those in apoA-1 group， and difference was highly statistically significant （P < 0.01）. The mRNA and protein levels of ABCA1 in apoA-1+BP group were higher than those in apoA-1 group， and the difference was statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. The expression levels of LXRα in apoA-1+BP group were higher than those in apoA-1 group， and the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. The SREBP1 and SREBP2 expression levels in apoA-1+BP group were lower than those in apoA-1 group， and the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. Conclusion BP can promote cholesterol efflux through the LXRα-ABCA1 pathway.

[Key words] Benzoylpaeoniflorin; Cholesterol efflux; Foam cells

心血管?。╟ardiovascular disease，CVD）在我國呈逐年上升趨勢，中國CVD現患病人數約2.9億[1]。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是CVD的主要致病原因[2]。AS主要是巨噬細胞和動脈壁平滑肌細胞過多的膽固醇累積導致細胞泡沫化，促進細胞內過量膽固醇流出是預防和治療AS的有效策略[3-4]。目前臨床上使用的促膽固醇流出藥物存在一定的毒副作用，如肝毒性、橫紋肌溶解等[5-6]。我國中醫中藥博大精深，近年來越來越多促膽固醇流出的中藥活性成分被分離和鑒定[7]。細胞膽固醇流出主要與血漿中高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）有關，載脂蛋白A-1（apoA-1）是HDL-C的主要成分和功能執行者，胞內膽固醇通過ABCA1運載到細胞膜，與apoA-1相互作用，促進膽固醇的流出[8-9]。固醇調節元件結合蛋白（SREBPs）是核轉錄因子，可調節膽固醇及三酰甘油代謝，對維持胞內膽固醇平衡起關鍵作用[10]。肝X受體α（LXRα）是一種核受體，可影響下游基因三磷酸腺苷結合盒轉運體A1（ABCA1）、SREBPs等的表達，調節細胞內膽固醇的平衡[11]。課題組前期研究發現，白芍提取物可增強泡沫細胞膽固醇的流出能力。故選用白芍醇提物苯甲酰芍藥苷（BP）研究其影響THP-1泡沫細胞膽固醇流出的機制，為BP治療AS提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 試驗材料

THP-1細胞由中南大學細胞中心提供。

1.2 藥物與試劑

BP（北京欣榮科技有限公司，批號：B20170912）;血清（Corning，批號：F160809-27）;佛波酯（PMA）（Promega，批號：P20181029）;乙?；兔芏戎鞍祝╝c-LDL）（Biochemical Techologies，批號：L20180312）;apoA-1（Sigma，批號：A180516J）;兔抗ABCA1抗體（Sigma，批號：A160523T）;[3H]-膽固醇（PerkinElmer，批號：H0182796）、兔一抗肝X受體α（LXRα）、SREBP1、SREBP2（Abcam公司）;兔一抗GAPDH抗體（Thermo Scientific，批號：TJ168764B）;辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔二抗（安徽經科生物科技有限公司，批號：J20170810）;Trizol試劑（Invitrogen，批號：17A0515J）;逆轉錄及qPCR試劑（大連寶生物工程有限公司，批號：R20170613）;總膽固醇試劑盒（普利萊基因有限公司，批號：TC20160924）;BCA測定試劑盒（碧云天生物科技有限公司，批號：20180213）。

1.3 細胞模型建立與分組

THP-1細胞在10%血清RPMI 1640培養基中培養（37℃、5%CO2）。將細胞傳代至6孔板，密度為2×106個/孔，加入PMA，使每孔終濃度為160 nmol/L，培養24 h，待THP-1細胞貼壁，移去含PMA培養基，加入并使其終濃度為0.2% BSA和50 μg/mL ac-LDL，培養48 h后，貼壁的THP-1細胞即可分化為泡沫細胞。本實驗分為ac-LDL組、apoA-1組和BP+apoA-1組。

1.4 觀察指標

1.4.1 膽固醇流出率比較測定 ?THP-1細胞接種到24孔板，密度為4×105個/孔，PMA誘導貼壁24 h;加入[3H]-膽固醇（終濃度為0.2 μCi/mL）和ac-LDL（終濃度為50 μg/mL），培養48 h，構建泡沫細胞模型，即ac-LDL組。apoA-1組，每孔加入500 μL含apoA-1的1640培養基（終濃度為 10 μg/mL），繼續培養24 h;apoA-1+BP組，加入apoA-1的同時，加入200 μg/mL BP作用24 h。收集每孔培養基，-20℃保存。每孔加入0.1 mol/L NaOH溶液500 μL，室溫靜置5 min，收集細胞裂解液，-20℃保存。[3H]-膽固醇放射強度用液體閃爍計數法測定，放射強度以cpm值計算（cpm值為[3H]-膽固醇放射強度即每分鐘閃爍的次數）。膽固醇流出率（%）=培養基cpm/（細胞裂解液cpm+培養基cpm）×100%。所有實驗均重復3次。

1.4.2 泡沫細胞總膽固醇濃度測定 ?PBS清洗各組細胞3次，收取細胞?？偰懝檀荚噭┖辛呀庖罕狭呀?0 min，5000 r/min離心5 min，離心半徑16 cm，取上清，分別進行總膽固醇含量測定，操作見試劑盒說明書。BCA法測定蛋白含量，以每克蛋白濃度對總膽固醇含量進行校正[μmol/（g·pro）]。

1.4.3 熒光定量PCR（qPCR）分析 ?收取各組細胞，按Trizol試劑說明書提取總RNA，以RNA為模板逆轉錄合成cDNA，qPCR試劑盒進行定量PCR分析，按試劑盒說明書操作。ABCA1-F：5′-TGCCAGAGTTATTAG-TGCCAAGT-3′，ABCA1-R：5′-GGGAATCAAAGCAG-GATGTTAG-3′;GADPH-F：5′-GTCCTGACTCACAG-CG-3′，GADPH-R：5′-ACACTGTGCTAGCAA-3′。

1.4.4 Western blot分析 ?THP-1細胞接種6孔板（2×106個/孔），按照說明書冰上裂解細胞并收取蛋白。在12%的分離膠進行SDS-PAGE電泳后，蛋白轉移至PVDF膜上，分別加入兔抗ABCA1抗體（1∶500）、LXRα抗體（1∶500）、SREBP1抗體（1∶1000）、SREBP2抗體（1∶1000），放于4℃冰箱中12 h，PBST清洗3次后用HRP標記的二抗結合2 h，顯影劑顯影。

1.5統計學方法

采用Grphad Prime 6.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組泡沫細胞膽固醇流出率比較

三組膽固醇流出率比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。apoA-1+BP組泡沫細胞膽固醇流出率高于apoA-1組，apoA-1組泡沫細胞膽固醇流出率高于ac-LDL組，差異均有高度統計學意義（均P < 0.01）。見圖1。

與ac-LDL組比較，###P < 0.001;與apoA-1組比較，**P < 0.01。ac-LDL：乙?；兔芏戎鞍?BP：苯甲酰芍藥苷

圖1 ? 三組泡沫細胞膽固醇流出率比較（n = 3）

2.2 三組泡沫細胞內總膽固醇濃度比較

ac-LDL組泡沫細胞內總膽固醇含量為（72.772±4.938）μmol/（g·pro），apoA-1組泡沫細胞內總膽固醇含量為（62.421±2.444）μmol/（g·pro），apoA-1+BP組總膽固醇含量為（44.205±3.867）μmol/（g·pro）。

apoA-1組泡沫細胞內總膽固醇含量低于ac-LDL組，差異有統計學意義（P < 0.05）。apoA-1+BP組總膽固醇含量低于apoA-1組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。見圖2。

與ac-LDL組比較，#P < 0.05;與apoA-1組比較，**P < 0.01。ac-LDL：乙?；兔芏戎鞍?BP：苯甲酰芍藥苷

圖2 ? 三組泡沫細胞內總膽固醇濃度比較（n = 3）

2.3 三組泡沫細胞ABCA1表達量比較

apoA-1+BP組泡沫細胞ABCA1 mRNA表達量比apoA-1組升高91.3%，apoA-1+BP組ABCA1蛋白表達量比apoA-1 組升高73.8%。

apoA-1+BP組ABCA1 mRNA、蛋白相對表達量高于apoA-1組，apoA-1組ABCA1 mRNA、蛋白表達量高于ac-LDL組，差異均有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。見圖3。

2.4 三組泡沫細胞LXRα蛋白表達水平比較

apoA-1+BP組LXRα蛋白表達水平高于apoA-1組，apoA-1組LXRα蛋白表達水平高于ac-LDL組，差異均有高度統計學意義（均P < 0.01）。見圖4。

2.5 三組泡沫細胞SREBPs蛋白表達水平比較

apoA-1+BP組SREBP1蛋白的表達水平比apoA-1組降低了27.7%，SREBP2蛋白表達水平比apoA-1組降低了56.2%。

apoA-1+BP組SREBP1、SREBP2蛋白的表達水平低于apoA-1組，apoA-1組SREBP1、SREBP2蛋白的表達水平低于ac-LDL組，差異均有高度統計學意義（均P < 0.01）。見圖5。

3 討論

AS是CVD發生發展的重要病理基礎，CVD防治的關鍵在于防治AS。提高HDL-C轉運膽固醇的能力，可促進膽固醇流出、抑制膽固醇合成，已成為目前防治AS的主要靶點[12]，中藥提取物防治AS活性成分已成為近年的研究熱點。中醫認為白芍有活血化瘀功效，有抗AS作用。白芍的主要成分有氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、芍藥內酯苷及芍藥苷等[13]。以芍藥為材料研發的白芍總苷膠囊和芍藥總苷膠囊已經在臨床上廣泛使用[14]。劉月麗等[15]研究發現白芍總苷可以降低脂肪肝模型鼠肝臟脂肪累積，保護肝功能。但目前尚未有針對白芍總苷單一單體抗AS分子機制的研究，本課題組前期實驗已經證實，氧化芍藥苷可升高過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）表達，PPARα上調下游基因ABCA1，進而促進泡沫細胞膽固醇流出[16]。

ABCA1是LXRα的下游基因，激活LXRα，增加ABCA1的表達[17]。ABCA1與apoA-1相互作用，將細胞內過多的膽固醇運到細胞外，調控細胞內總膽固醇的平衡[18]。本研究結果顯示，apoA-1+BP組膽固醇流出率高于apoA-1組，總膽固醇含量低于apoA-1組。

本研究結果顯示apoA-1+BP組ABCA1 mRNA和蛋白表達量均高于apoA-1組，提示BP通過上調ABCA1的表達促進膽固醇流出。ABCA1是細胞內膽固醇流出的“調速器”[19]，轉錄、翻譯和加工等受到上游轉錄因子LXRα的調節。本研究結果顯示，apoA-1+BP組LXRα蛋白的表達水平高于apoA-1組，提示BP通過LXRα-ABCA1通路促進膽固醇流出。

有研究[20-21]報道，中藥活性物可下調SREBPs的表達，降低細胞內膽固醇濃度。前期實驗結果顯示[22]，中藥穿龍薯蕷提取物甲基薯蕷皂苷元可抑制SREBPs表達，減少細胞內miRNA33a/b含量，提高ABCA1的轉錄和翻譯，增強膽固醇流出能力。

綜上所述，apoA-1+BP組SREBP1、SREBP2蛋白相對表達量分別比apoA-1組有明顯下降趨勢，提示BP能夠抑制泡沫細胞SREBPs的表達，而BP抑制SREBPs表達的機制需在后續試驗中研究。

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（收稿日期：2019-11-21 ?本文編輯：劉明玉）