胎盤間充質干細胞對大鼠子宮內膜損傷的修復作用

王香香 王焱 楊稍稍 張俊俊

[摘要] 目的 研究胎盤間充質干細胞對大鼠子宮內膜損傷的修復作用。 方法 2019年5～11月使用化學損傷法對60只雌性SD大鼠（南京市江寧區青龍山動物繁殖場）構建子宮內膜損傷模型，采用單純隨機抽樣分為對照組、凝膠組、模型組，每組各20只。3個動情周期后，每組采用單純隨機抽樣抽取10只大鼠行HE染色測量子宮內膜腺體數目、子宮內膜厚度，Masson染色測量子宮內膜纖維化面積百分比。其他30只大鼠與雄鼠合籠，受孕第10天，開腹觀察大鼠子宮胚胎個數。 結果 與對照組比較，模型組子宮內膜腺體數目減少、子宮內膜厚度變薄、子宮內膜纖維化面積百分比升高、受孕大鼠子宮胚胎個數減少，差異有統計學意義（P < 0.05）。與模型組比較，凝膠組子宮內膜腺體數目增加、子宮內膜厚度增高、子宮內膜纖維化面積百分比降低，受孕大鼠子宮胚胎個數增多，差異有統計學意義（P < 0.05）。與對照組比較，凝膠組子宮內膜腺體數目、子宮內膜厚度無明顯變化，差異無統計學意義（P > 0.05）;子宮內膜纖維化面積百分比升高，受孕大鼠子宮胚胎個數減少，差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 胎盤間充質干細胞可一定程度地修復損傷的子宮內膜，增加子宮內膜腺體數目、子宮內膜厚度，降低子宮內膜纖維化面積百分比，提高胚胎著床率。

[關鍵詞] 胎盤間充質干細胞;子宮內膜損傷;子宮內膜腺體計數;子宮內膜厚度;子宮內膜纖維化面積百分比

[中圖分類號] R730.53 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）04（a）-0018-05

Repair effect of placental mesenchymal stem cells on endometrial injury in rats

WANG Xiangxiang1，2 ? WANG Yan1，2 ? YANG Shaoshao1，2 ? ZHANG Junjun2

1.College of Clinical Medical， He′nan University of Science and Technology， He′nan Province， Luoyang ? 471003， China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology， the First Affiliated Hospital of He′nan University of Science and Technology， He′nan Province， Luoyang ? 471003， China

[Abstract] Objective To study the repair effect of placental mesenchymal stem cells on endometrial injury in rats. Methods From May to November 2019， a total of 60 female SD rats （Qinglongshan Animal Breeding Farm， Jiangning District， Nanjing） were constructed endometrial injury models by chemical damage method， and they were divided into control group， gel group and model group by simple random sampling， with 20 rats in each group. After three estrous cycles， 10 rats from each group were randomly sampled for HE staining， and the number of endometrial glands and endometrial thickness were measured， while the percentage of endometrial fibrosis were measured by Masson staining. The other 30 rats were caged with male rats. On the 10th day of conception， the number of uterine embryos in the rats was observed by laparotomy. Results Compared with the control group， the number of endometrial glands decreased， the thickness of the endometrium became thinner， the percentage of endometrial fibrosis increased， while the number of uterine embryos in pregnant rats decreased in the model group， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. Compared with the model group， the number of endometrial glands increased， the thickness of the endometrium increased， the percentage of endometrial fibrosis area decreased， while the number of uterine embryos in pregnant rats increased in the gel group， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. Compared with the control group， the number of endometrial glands and endometrial thickness had no significant changes in the gel group， and the differences were not statistically significant （P > 0.05）; while the percentage of endometrial fibrosis increased， the number of uterine embryos in pregnant rats decreased， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Placental mesenchymal stem cells can repair damaged endometrium， increase the number of endometrial glands and endometrial thickness， reduce the percentage of endometrial fibrosis area， and improve embryo implantation rate.

[Key words] Placental mesenchymal stem cells;Endometrial injury;Endometrial gland count;Endometrial thickness; Percentage of endometrial fibrosis area

正常女性月經周期靠子宮內膜功能層周期性變化來維持，而基底層保持不變。隨著醫學的發展，人工流產、診斷性刮宮等宮腔操作的增加，子宮內膜損傷成婦產科常見疾病，且隨宮腔操作次數的增加而增加，造成月經減少、閉經、不孕等情況，給廣大女性患者及其家庭帶來極大的心理、經濟、社會負擔。目前關于子宮內膜損傷的治療方法包括放置宮內節育器、口服激素藥物及宮腔鏡治療。然而效果并不理想，子宮內膜損傷后修復障礙成為婦產科領域解決的難題之一。將骨髓間充質干細胞[1]應用于重度宮腔粘連患者，有一定效果。但采集骨髓是再次創傷過程，增加患者感染等風險，且骨髓干細胞數量相對較少，影響因素較多，如年齡、健康情況等。胎盤間充質干細胞來源充足、取材方便，不增加產婦創傷。相對于其他干細胞，骨髓干細胞有分化能力較強、極低的免疫排斥反應等優點，引起越來越多的國內外學者們關注。通過構建大鼠子宮內膜損傷模型，立即宮腔移植胎盤間充質干細胞凝膠，觀察子宮內膜腺體計數、子宮內膜厚度、子宮內膜纖維化面積百分比及受孕大鼠子宮胚胎個數，并分析胎盤間充質干細胞對大鼠子宮內膜損傷的修復作用，可能為修復損傷后的子宮內膜提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 實驗設計

隨機對照動物實驗。

1.2 實驗時間及地點

實驗于2019年5～11月在河南科技大學第一附屬醫院（以下簡稱“我院”）完成。

1.3 實驗材料

1.3.1 實驗動物及飼養環境 ?未交配7～9周SD雌性大鼠60只、雄性大鼠10只SPF級，體重200～220 g。動物合格證號：201905293，生產許可證號：SCXK（蘇）2017-0001。購買后常規飼養1周，室溫22～24℃，保證充足的鼠糧和水。遵循國家制訂的有關動物實驗保護和使用指南，并經我院動物倫理委員會批準。

1.3.2 實驗細胞 ?胎盤間充質干細胞凝膠由北京漢氏聯合生物技術股份有限公司所贈。

1.3.3 主要實驗試劑 ?95%乙醇（洛陽市潔康消毒劑廠，生產批號：180508）;結晶紫（上海試劑四廠，生產批號：20180308）;蘇木精伊紅染液（無錫市江原實業技貿總公司，生產批號：190610）;Masson染液（北京索萊寶科技有限公司，生產批號：20190829）。

1.3.4 主要儀器 ?電腦程控組織包埋機（襄攀徠克生物電子儀器廠，型號：PPDB-21C）;蠟塊切片RM2235（Leica德國）;電烤箱（上海精宏實驗設備有限公司，型號：DHG-9070A）;熒光倒置顯微鏡（日本，型號：Nikon Eclipse 80i）。

1.4 實驗方法

1.4.1 大鼠子宮內膜損傷模型建立 ?參照張婷等[2]大鼠陰道分泌物涂片，結晶紫染色觀察大鼠動情周期，于動情期（滿視野無核角化細胞）造模。參考許春燕等[3]造模方法的改進，5%水合氯醛溶液麻醉（6 mL/kg），麻醉后取仰臥位。消毒后在下腹正中切口，恥骨聯合上2 cm，打開腹膜，進入腹腔，輕輕夾出“V”型子宮。無菌生理鹽水紗布保護子宮周圍，0號縫合絲線活結結扎子宮兩端，結扎力度適中。輕微拉直子宮，1 mL注射器針頭進入宮腔，平行與子宮縱軸，注射95%乙醇約0.4 mL，使子宮呈充盈狀態，且保持無液體明顯溢出。作用約5 min將95%乙醇吸出，生理鹽水沖洗宮腔3遍，松解子宮兩端結扎線，觀察子宮恢復情況。后將左側子宮輕輕送回，同法處理右側子宮，后逐層關腹，送至保溫箱待其肌張力恢復，送動物房。

1.4.2 造模成功評價標準 ?病理形態學觀察：模型組宮腔縮小，子宮內膜凸起不明顯，子宮內膜上皮呈偏平狀或低柱狀，子宮內膜變薄、子宮內膜間質腺體數量減少，子宮內膜間質纖維化明顯。

1.4.3 實驗分組 ?60只雌性大鼠采用單純隨機抽樣方法，通過隨機數字表法分對照組、模型組、凝膠組，每組各20只。對照組僅行開關腹;模型組參照造模方法進行造模;凝膠組造模后立即（6～8 min）宮腔移植胎盤間充質干細胞凝膠0.1 mL。術后3個動情周期，每組采用單純隨機抽樣方法，抽取10只大鼠斷頸處死，獲取大鼠雙側中段子宮標本各1份，經固定、脫水、透明、浸蠟包埋制成蠟塊;其余雌性大鼠當天與雄鼠同籠，同籠雌雄比為3∶1，次日發現大鼠陰栓作為受孕當天，受孕10 d后，麻醉下開腹觀察大鼠雙側子宮胚胎個數。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 HE染色 ?以4 μm厚度連續切片，脫蠟水化，蘇木精染色5 min，1%鹽酸酒精分化3 s，1%氨水中藍化3 s，伊紅溶液染色4 min，脫水、透明、中性樹膠封片。子宮內膜腺體計數：每張切片隨機選取4個不同高倍視野（200×），計腺體數量，取平均值。子宮內膜厚度（100×）：通過計算機圖像分析系統測量子宮肌層與內膜交界處至宮腔的垂直距離，切片4個象限中子宮內膜的厚度，取平均值。

1.5.2 Masson染色 ?脫蠟前同HE染色，Weigert鐵蘇木精染色5 min，酸性乙醇分化液分化5 s，Masson藍化液返藍5 s，麗春紅染色5 min，弱酸工作液1 min，磷淚酸溶液1 min，弱酸工作液1 min，苯胺藍染色液1 min，脫水、透明、中性樹膠封片。子宮內膜纖維化面積百分比：每張Masson切片隨機選取4個高倍視野（200×），通過計算機圖像分析系統測量每個視野子宮內膜間質纖維化面積與子宮內膜間質和腺體總面積的百分比比值，取平均值。

1.6 統計學方法

通過SPSS 19.0軟件對所得數據進行統計分析，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠術后狀況

三組大鼠術后覓食、飲水狀態如常，眼神有光，毛色順亮，精神狀態良好，無感染及死亡。

2.2 染色結果

2.2.1 HE染色

2.2.1.1 病理形態學觀察 ?對照組子宮腔形態呈不規則狀，可見凸起的子宮內膜，子宮內膜上皮呈高柱狀，子宮內膜腺體豐富。凝膠組宮腔形態呈不規則狀，可見凸起的子宮內膜，子宮內膜上皮呈高柱狀，內膜腺體較多，子宮內膜纖維細胞較正常組多。模型組宮腔明顯縮小，子宮內膜凸起不明顯，子宮內膜上皮呈偏平狀或低柱狀，內膜間質腺體數量減少，子宮內膜間質纖維化明顯。見圖1（封三）。

2.2.1.2 各組子宮內膜腺體計數及子宮內膜厚度比較 ?各組子宮內膜腺體數量整體比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。進一步兩兩比較，模型組子宮內膜腺體計數明顯少于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）。凝膠組子宮內膜腺體計數明顯多于模型組，差異有統計學意義（P < 0.05）。各組子宮內膜厚度整體比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。進一步兩兩比較，模型組子宮內膜厚度顯著低于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）。凝膠組子宮內膜厚度明顯高于與模型組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表1。

表1 ? 各組子宮內膜腺體計數及子宮內膜厚度比較（x±s）

注：與對照組比較，aP < 0.01;與模型組比較，bP < 0.01

2.2.2 Masson染色

2.2.2.1 病理形態學觀察 ?對照組子宮內膜腺體、上皮呈紅色，子宮內膜可見梭形單束狀淺藍色膠原纖維，規律排列。凝膠組子宮內膜腺體、上皮呈紅色，子宮內膜膠原纖維呈藍色，部分區域呈藍色片狀。模型組子宮內膜腺體、上皮呈紅色，子宮內膜膠原纖維呈藍色，排列不規律、雜亂狀，大多數區域呈藍色片狀。見圖2（封三）。

2.2.2.2 子宮內膜纖維化面積百分比 ?各組子宮內膜纖維化面積百分比整體比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。進一步兩兩比較，凝膠組及模型組子宮內膜纖維化面積百分比顯著高于對照組，且凝膠組低于模型組，差異有統計學意義（P < 0.05）。

2.3 受孕大鼠子宮胚胎個數

2.3.1 各組子宮胚胎個數觀察

對照組大鼠子宮胚胎數量最多且無死胎現象。凝膠組大鼠胚胎數量較正常組減少，未發現有死胎現象。模型組大鼠子宮胚胎數量稀疏，部分大鼠單側子宮無胚胎著床，個別大鼠子宮胚胎著床后出現死胎現象。見圖3。

A：對照組;B：凝膠組;C：模型組

圖3 ? 各組子宮胚胎個數觀察

2.3.2 各組子宮胚胎個數

各組子宮胚胎個數總體比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。進一步兩兩比較，模型組子宮胚胎數顯著少于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）。凝膠組子宮胚胎個數顯著多于模型組，且顯著少于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表2。

表2 ? 各組子宮胚胎個數（x±s）

注：與對照組比較，aP < 0.01;與模型組比較，bP < 0.01

3 討論

研究中選用胎盤間充質干細胞凝膠修復大鼠損傷的子宮內膜，考慮胎盤間充質干細胞凝膠自身流動性較差，宮腔既不能移植過多，也要保證凝膠均勻覆蓋子宮內膜，選用造模后立即（6～8 min）宮腔移植0.1 mL（1×105細胞數）胎盤間充質干細胞凝膠。實驗結果顯示，胎盤間充質干細胞可增加子宮內膜腺體數量、增加子宮內膜厚度和胚胎著床率、降低子宮內膜纖維化面積百分比，對子宮內膜損傷有一定的修復作用。提示子宮內膜損傷后立即宮腔移植0.1 mL（1×105細胞數）胎盤間充質干細胞凝膠是可行的，為子宮內膜損傷修復提供一種新方法。在人工流產、診斷性刮宮等宮腔操作術后，立即移植胎盤間充質干細胞凝膠修復損傷后的子宮內膜，可以預防或者降低術后子宮內膜損傷帶來的一系列問題，如宮腔粘連、月經稀發、不孕、流產等。但研究為動物實驗，若能證實胎盤間充質干細胞無致瘤性及安全性，進行臨床實驗研究，在婦產科領域特別是生殖醫學領域修復子宮內膜損傷可能帶來巨大影響。但研究中存在樣本量較小、觀察時間較短等局限性，需要更大的樣本量及較長的觀察時間進一步研究。

大多數認為干細胞可能是通過信號通路、遷移、分泌、造血、免疫調節及其向多種細胞分化的功能[4-9]修復受損組織。關于間充質干細胞修復子宮內膜損傷的研究相對較多[10-18]，牛婷等[19]研究顯示，子宮內膜損傷后15 d移植胎盤間充質干細胞懸液（1×1010細胞數）修復子宮內膜。結果顯示，胎盤間充質干細胞對子宮內膜損傷具有不同程度地修復作用，其效果可能宮腔移植組較靜脈移植組較好?？紤]其可能原因宮腔移植組的局部細胞濃度高于靜脈移植組的宮腔細胞濃度或者通過其他途徑來發揮效應。趙靜等[20]研究顯示，骨髓間充質干細胞早期（造模后6～8 h移植）宮腔移植組與晚期（造模后12 d移植）宮腔移植組同樣對子宮內膜損傷均有一定的修復效果，但其最佳移植時機仍無定論。就其細胞移植時機來說值得肯定的是，子宮內膜損傷后立即宮腔移植間充質干細胞，可減少二次宮腔操作對子宮所帶來的損傷。若應用于臨床工作中，不僅減少了二次宮腔操作對子宮內膜的再損傷，在一定程度上減輕患者心理、經濟負擔，更避免了醫療資源浪費等優勢。本研究選用子宮內膜損傷后立即宮腔移植胎盤間充質干細胞凝膠，實驗結果顯示胎盤間充質干細胞凝膠對子宮內膜損傷有一定的修復作用，還避免二次宮腔操作對子宮內膜的再次損傷，同時達到宮腔注射的局部高濃度狀態，使研究目的真正接近臨床。

目前，關于間充質干細胞對子宮內膜損傷的研究多數停留在動物實驗階段，對其致瘤性及安全性仍無統一意見，胎盤間充質干細胞有望成為治療子宮內膜損傷的理想細胞。如何選取胎盤間充質干細胞的最佳移植時機、最佳移植濃度及應用于臨床的安全性，仍需大量的動物及臨床試驗。

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