景衣安神散穴位貼敷對失眠大鼠神經遞質影響的實驗研究

胡金霞 盧軍 王洪霞 江鈺 劉濤 胡曉靈

[摘要] 目的 探討景衣安神散穴位貼敷對失眠大鼠神經遞質的影響。 方法 將雄性大鼠64只按隨機數字表法分為四組，每組16只，分別為對照組、模型組、空白組、實驗組。對照組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液（1 mL/100 g），1次/d，連續注射2 d，不進行任何干預，連續飼養7 d。模型組、空白組、實驗組均采用腹腔注射對苯丙氨酸（PCPA），1次/d，連續注射2 d，制造睡眠剝奪模型。模型組造模后，不進行任何干預，連續飼養7 d?？瞻捉M造模后，將空白敷膜貼于神闕、內關穴，1次/d，30 min/次，連續7 d。實驗組造模后，將景衣安神散貼敷于神闕、內關穴，1次/d，30 min/次，連續7 d。實驗第8天，大鼠斷頭，開顱取出腦組織，分離出下丘腦，洗凈剪碎，勻漿取上清液，采用酶聯免疫吸附測定法檢測5-羥色胺（5-HT）、5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）、多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NANE）含量。結果 模型組、空白組、實驗組大鼠的力竭時間均短于對照組，絕望時間均長于對照組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）?？瞻捉M、實驗組大鼠的力竭時間均長于模型組，絕望時間均短于模型組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。模型組、空白組大鼠下丘腦5-HT含量均低于對照組，實驗組大鼠下丘腦5-HT含量高于模型組、空白組，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。模型組、空白組大鼠下丘腦5-HIAA含量均低于對照組，實驗組大鼠下丘腦5-HIAA含量高于模型組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。模型組、空白組大鼠下丘腦DA含量均高于對照組，實驗組大鼠下丘腦DA含量低于模型組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。模型組、空白組大鼠下丘腦NANE含量均高于對照組，實驗組大鼠下丘腦NANE含量低于模型組、空白組，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。 結論 景衣安神散穴位貼敷失眠大鼠可能通過影響下丘腦神經遞質水平的變化來改善睡眠。

[關鍵詞] 景衣安神散;穴位貼敷;動物實驗;單胺遞質

[中圖分類號] R-332 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）04（a）-0013-05

Experimental study on the effect of acupoint application of Jingyi Anshen Powder on neurotransmitters in rats with insomnia

HU Jinxia1 ? LU Jun2 ? WANG Hongxia1 ? JIANG Yu1 ? LIU Tao1 ? HU Xiaoling1

1.Department of Geriatrics， Xinjiang Uygur Autonomous Region Institute of Traditional Chinese Medicine， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi ? 830000， China; 2.Department of Pharmacy， Xinjiang Uygur Autonomous Region Institute of Traditional Chinese Medicine， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi ? 830000， China

[Abstract] Objective To explore the effect of acupoint application of Jingyi Anshen Powder on neurotransmitters in rats with insomnia. Methods According to the random number table method， 64 male rats were divided into four groups： control group （n = 16）， model group （n = 16）， blank group （n = 16） and experimental group （n = 16）. Control group was intraperitoneally injected with 0.9% Sodium Chloride Solution （1 mL/100 g） once a day for 2 days， and fed continuously for 7 days without any intervention. Model group， blank group and experimental group were all injected intraperitoneally with P-phenylalanine （PCPA） once a day for two consecutive days to create a sleep deprivation model. After molding， model group was fed for 7 days without any intervention. After molding， in blank group， blank film was applied to shenque and neiguan acupoints once a day， 30 minutes a time for 7 days. After molding， in experimental group， Jingyi Anshen Powder was applied to shénquē and nèigu？觀n acupoints once a day for 30 minutes for 7 days. On the 8th day of the experiment， the rats were decapitated， the brain tissues were taken out after craniotomy， the hypothalamus was separated， washed and chopped， and the supernatant was taken from the homogenate. Contents of 5-hydroxytryptamine （5-HT）， 5-hydroxyindoleacetic acid （5-HIAA）， dopamine （DA） and noradrenaline （NANE） were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Results The exhaustion time of model group， blank group and experimental group was shorter than that of control group， and the despair time of model group， blank group and experimental group was longer than that of control group， the differences were statistically significant （P < 0.01）. The exhaustion time of blank group and experimental group was longer than that of model group， and the desperation time of blank group and experimental group was shorter than that of model group， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. The contents of 5-HT in model group and blank group were lower than that in control group， the contents of 5-HT in experimental group was higher than that in model group and blank group， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. The contents of 5-HIAA in model group and blank group were lower than that in control group， while the content of 5-HIAA in experimental group was higher than that in model group， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. DA contents of hypothalamus in model group and blank group were higher than that in control group， DA content of hypothalamus in experimental group was lower than that in model group， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. The contents of hypothalamic NANE in model group and blank group were higher than that in control group， the contents of hypothalamic NANE in experimental group were lower than that in model group and blank group， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Jingyi Anshen Powder is applied to the acupoints of insomnia rats to improve sleep by affecting the changes of the level of neurotransmitters in the hypothalamus.

[Key words] Jingyi Anshen Powder; Acupoint application; Animal experiment; Monoamine transmitter

失眠是指經常不能獲得正常睡眠為特征的病癥。隨著社會發展，失眠的發病率呈現上升趨勢。在前期臨床試驗中，我們應用中藥結合新疆地產藥物組方的“景衣安神散”穴位貼敷治療失眠，可改善患者夜間的睡眠質量，有效提高患者白天的功能狀態，對睡眠有調節作用[1-5]。本研究采用景衣安神散穴位貼敷于對苯丙氨酸（PCPA）致失眠大鼠模型的神闕、內關穴進行治療，檢測其下丘腦單胺類遞質5-羥色胺（5-HT）、5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）、多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NANE）的水平，進一步探討景衣安神散穴位貼敷治療失眠癥的作用機制，為臨床提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 樣本量的確定

根據前期預實驗結果，得出景衣安神散穴位貼敷治療失眠大鼠的總體有效率，根據多樣本比較最小樣本量計算公式，計算得出每組樣本≥10只。

1.2 實驗動物及分組

遵循我國科技部發財字（2006）398號《關于善待實驗動物的指導性意見》有關規定對動物進行處置。雄性大鼠64只，由新疆維吾爾自治區疾病預防控制中心提供，許可證號：SCXK（新）2003-0002，體重（200±20）g，正常飼養。飼養條件為飼養室溫度20～25℃，相對濕度50%～65%，光照充分，定時通風換氣，飼養期間大鼠自由攝水及飲食。飼養1周后，采用隨機數字表法將其分為四組，每組16只，分別為對照組、模型組、空白組、實驗組。其中模型組、空白組以及實驗組采用腹腔注射PCPA的方法制造睡眠剝奪模型[6]。

1.3 PCPA致失眠大鼠模型的構建

1.3.1 失眠模型的建立方法

將PCPA（艾覽化工科技有限公司，貨號：A46786）用弱堿性生理鹽水配置成混懸液，按45 mg/100 g體重腹腔注射，1次/d，連續注射2 d，造模成功。

1.3.2 造模成功的評判標準

造模后的大鼠，與對照組進行比較，行為發生改變，如晝夜節律顛倒，白天活動明顯增多，睡眠時間反而減少，性情煩躁，攻擊性增強，如出現這些變化，表明造模成功[7]。

1.4 動物的處理

對照組：腹腔注射0.9%氯化鈉溶液（1 mL/100 g），1次/d，連續注射2 d;不進行任何干預，連續飼養7 d。模型組：造模后，不進行任何干預，連續飼養7 d?？瞻捉M：造模后，每天將空白敷膜貼敷于神闕、內關穴[8-10]。貼敷方法：固定大鼠后，將穴位附近的毛剪短，脫凈，約1 cm2大小，常酒精消毒，空白敷膜貼敷于穴位上，1次/d，30 min/次，連續7 d。實驗組：造模后，將景衣安神散貼敷于神闕、內關穴，貼敷方法同空白組，1次/d，30 min/次，連續7 d。

1.5 觀察指標

1.5.1 大鼠一般行為觀察

于造模后以及治療后每天觀察大鼠晝伏夜出的節律，白天活動以及睡眠情況，精神狀態、性情變化，并記錄變化。

1.5.2 強迫游泳實驗與懸尾實驗

于實驗第7天對各組大鼠均進行實驗學檢測[強迫游泳實驗（FST）[11]、懸尾實驗（TST）[12]]。記錄大鼠的不動時間（IM）。

1.5.2.1 FST ?大鼠被放置在一個單獨的垂直玻璃管（高50 cm，直徑20 cm，其中水的高度30 cm，水溫25℃）中，并開始計時。當大鼠頭部沉入水中內，不能浮出水面時，將其撈出，并記錄力竭時間。

1.5.2.2 TST ?大鼠被懸掛在距離桌面50 cm高的水平環狀架桿，用膠帶固定鼠尖2 cm，記錄大鼠6 min內的不動時間，即絕望時間。

1.5.3 單胺遞質的檢測

實驗第8天，大鼠斷頭，開顱取出腦組織，分離出下丘腦，在冷生理鹽水中洗去血液，稱重后，置于 -85℃低溫冰箱保存備用。

1.5.3.1 組織勻漿 ?從冰箱中取出已經沖洗并稱重的腦組織進行剪碎，與對應體積的PBS（一般按1∶9的重量體積比，PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨。后勻漿液進行超聲破碎或反復凍觸。最后將勻漿液以5000×g離心5～10 min，取上清檢測。

1.5.3.2 檢測方法 ?用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測下丘腦5-HT、5-HIAA、DA、NANE的含量[9]（5-HT試劑盒E-EL-0033C96T、5-HIAA試劑盒E-EL-0075C96T、DA試劑盒E-EL-0046C96T、NANE試劑盒E-EL-00475C96T，均由武漢伊萊瑞特生物科技有限公司生產）。

1.6 統計學方法

采用SPSS 23.0統計軟件進行統計學處理。符合正態分布的計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性采用Levene法檢驗，兩兩比較采用LSD法，方差不齊時用Tamhane′s法檢驗，多個樣本均數間兩兩比較采用Bonferroni法。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 失眠大鼠行為學變化

模型組大鼠于腹腔注射PCPA后第1天，與空白組比較，晝伏夜出節律紊亂，白天活動頻繁，睡眠明顯減少，興奮性增高，好動易怒，有攻擊性，情緒極其不穩定;第3、4天后，大鼠變得萎靡不振，興奮性降低，容易受外界影響而驚醒活動?？瞻捉M、實驗組在接受治療后第1天，與模型組比較，大鼠攻擊性逐漸減弱，相對安靜;在治療后的第2～4天，實驗組大鼠攻擊性進一步減弱，困倦乏力，喜歡睡臥，活動減少，出現睡意，不容易被外界驚醒;在治療后的第5～7天，基本趨于正常，晝伏夜出，節律恢復正常，白天睡覺，夜晚活動，睡眠-覺醒周期與對照組趨于相同。

2.2 各組大鼠力竭時間和絕望時間比較

模型組、空白組、實驗組大鼠的力竭時間均短于對照組，絕望時間均長于對照組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）?？瞻捉M、實驗組大鼠的力竭時間均長于模型組，絕望時間均短于模型組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。見表1。

表1 ? 各組大鼠力竭時間和絕望時間比較（ms，x±s）

注：與對照組比較，*P < 0.01;與模型組比較，#P < 0.01

2.3 各組大鼠下丘腦5-HT和5-HIAA含量比較

模型組、空白組大鼠下丘腦5-HT含量均低于對照組，實驗組大鼠下丘腦5-HT含量高于模型組、空白組，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。模型組、空白組大鼠下丘腦5-HIAA含量均低于對照組，實驗組大鼠下丘腦5-HIAA含量高于模型組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。見表2。

表2 ? 各組大鼠下丘腦5-HT和5-HIAA含量比較（ng/mL，x±s）

注：與對照組比較，*P < 0.01;與模型組比較，#P < 0.01;與空白組比較，△P < 0.05。5-HT：5-羥色胺;5-HIAA：5-羥吲哚乙酸

2.4 各組大鼠下丘腦DA含量比較

模型組、空白組大鼠下丘腦DA含量均高于對照組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。實驗組大鼠下丘腦DA含量低于模型組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。見表3。

2.5 各組大鼠下丘腦NANE含量比較

模型組、空白組大鼠下丘腦NANE含量均高于對照組，實驗組大鼠下丘腦NANE含量低于模型組、空白組，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。見表4。

表4 ? 各組大鼠下丘腦NANE含量比較（ng/mL，x±s）

注：與對照組比較，*P < 0.01;與模型組比較，#P < 0.01;與空白組比較，△P < 0.05。NANE：去甲腎上腺素

3 討論

失眠中醫稱之為“不寐”“不得眠”，為臨床常見病。失眠是由于“衛氣不得入于陰，常留于陽。留于陽則陽氣滿，陽氣滿則陽蹺盛，不得入于陰則陰氣虛，故目不暝矣”?！端貑枴ぶ琳嬉摗吩唬骸爸敳礻庩査诙{之，以平為期?！敝委熓叩年P鍵在于調節陰陽的偏盛偏衰，疏通經絡，促使機體歸于“陰平陽秘”，恢復正常的生理功能。

本實驗采用景衣安神散，該方是胡曉靈主任醫師根據失眠的病因病機，結合新疆地域特色，選擇新疆地產藥物及中藥組方治療本病。其方主要由紅景天、薰衣草、石菖蒲等組成。其中薔薇紅景天補肺脾腎精元之氣，以養血、扶正固本?，F代藥理研究表明，紅景天可以增強腦功能，消除疲勞，鎮定安神[13];薰衣草有行氣活血、提神醒腦、疏解焦慮、改善失眠的功效[14];石菖蒲解郁化濁。以上各藥共奏益氣活血、化痰解郁、養心安神之效。取穴神闕、內關。神闕為生命的關口、人體經脈之根本、經絡之總樞、經氣之匯海，通過任、督、沖、帶四脈而統屬全身經絡，聯系五臟六腑。在正常情況下，任、督、沖、帶脈經氣相通，陰陽相濟，調節各臟腑、經絡的正常生理活動。根據“內病外治”理論，貼敷神闕穴，通過刺激神闕穴調整任、督、沖、帶的功能，以調和諸臟腑氣血陰陽，達到陰平陽秘的治療目的。內關乃手厥陰心包經絡穴，別走手少陽三焦經，是八脈交會穴中陰維脈的會穴，主治本經經病和胃、心、心包絡疾患，以及與情志失和、氣機阻滯有關的臟腑器官、肢體病變，有養心安神之功，維系諸陰之經。刺激內關，可以調攝陰陽，調和氣血，維持內環境，達到陰平陽秘的目的。景衣安神散通過內關、神闕穴位貼敷療法，可以刺激穴位，依靠經絡循行的傳輸發揮藥物作用;同時穴位局部的藥物通過微小血管的吸收到達體內產生作用。這個吸收過程不刺激胃腸道，不經過肝腎代謝，可以明顯降低藥物在體內的毒副作用。由于藥物在穴位局部濃度相對最高，可以維持穩定持久的血藥濃度，減少給藥次數[15]。我們在前期臨床研究中觀察到，景衣安神散通過刺激雙側涌泉以及神闕穴位，達到內病外治的作用，調整陰陽，引陽入陰，使晝夜陰陽運轉恢復正常，對改善睡眠有明顯作用[1-5]。

失眠的發病機制尚不明確，有研究認為，失眠與機體神經-免疫、中樞神經遞質、抗氧化等系統調控密切相關[16]。有研究認為，腦橋背內側被蓋的藍斑頭部、視交叉上核和丘腦、腦干的中縫核等特定結構以及中樞神經系統內神經遞質的作用與失眠關系密切[17]。存在腦內藍斑頭部和橋腦的NA神經元，與快波睡眠有關，是快波睡眠的“執行機制”，在維持覺醒中起著重要作用[18]。中腦的DA神經元有維持覺醒和行為興奮的作用。5-HT是引發非快速動眼睡眠的重要神經遞質，被認為是腦內的“致眠因子”。5-HT可部分介導中縫背核對睡眠-覺醒進行調節作用。5-HT合成的限速酶是色氨酸氫化酶（TDH），而PCPA為TDH的抑制劑，故PCPA可以耗竭中樞神經內的5-HT[19-20]。5-HIAA作為5-TH生成的無活性酸性代謝產物而存在，其可反映5-TH的水平[21]。有研究發現，通過升高腦內5-HT、5-HIAA含量，降低DA、NE含量，可以明顯改善睡眠[22]。

本研究對大鼠腹腔注射PCPA后，正常的睡眠-覺醒周期遭到破壞，絕望時間縮短，力竭時間延長，出現晝夜節律紊亂，白天活動明顯增多，失眠，焦慮，煩躁不安，易驚嚇，夜晚萎靡不振，嗜睡少動。本研究發現，模型組大鼠下丘腦5-HT以及其代謝產物5-HIAA含量均降低，DA及NANE含量升高，與對照組比較，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）。上述結果提示失眠與神經遞質的水平變化有關。5-HT及其代謝產物5-HIAA可幫助睡眠，DA及NANE含量升高，可引起覺醒，導致失眠。經穴位貼敷治療后發現，失眠大鼠的行為發生改變，絕望時間延長，力竭時間縮短，大鼠的攻擊性逐漸減弱，困倦乏力，喜歡睡臥，白天活動減少，夜晚活動增多，晝伏夜出節律恢復正常，睡眠-覺醒周期趨于恢復正常。與模型組比較，實驗組可降低失眠大鼠下丘腦中的5-HT，升高其代謝產物5-HIAA，同時升高下丘腦中的DA，降低NANE含量，與模型組比較，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）。通過調節下丘腦神經遞質水平變化，達到陰平陽秘、恢復睡眠的目的。

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（收稿日期：2019-10-09 ?本文編輯：李亞聰）