定量檢測4 種清熱解毒類中藥注射液中細菌內毒素的試驗方法

張旭，郝欣嶺，程曉嶺

（神威藥業集團有限公司，河北 石家莊 051430）

0 引言

目前，細菌內毒素檢查（BET）法應用在注射劑新藥品品種的臨床研究較多但是使用BET 法的藥品大部分是西藥，未見靜脈中藥或者中草藥注射劑，且相關的臨床研究較少，且發展局處于摸索階段[1]。中草藥靜脈注射劑制備過程較為復雜且中藥材的來源不等，容易引起熱原，中國藥典與各種藥品標準中針對中草藥靜脈注射劑無詳細的規定熱原檢查項目，之前使用的家兔檢查法成本高且費時，過程繁瑣，準確性低，標準化差，大部分制藥廠及醫院均無此項檢查，進而為臨床用藥造成較大的安全隱患[2]?；谏鲜霰尘?，本次研究就定量檢測4 種清熱解毒類中藥注射液中細菌內毒素的試驗方法展開分析，闡述如下。

1 材料與儀器

1.1 所選儀器。賽默飛世爾科技公司提供的FC 型內毒素儀，湛江安度斯生物有限公司提供的生物探針；津藥典標準儀器廠提供的渦旋振蕩混合器。

1.2 所選藥品及試劑。4 種藥品包括清開靈注射液、復方半邊蓮注射液、茵梔黃注射液及雙黃連注射液。細菌內毒素標準品、檢查水、檢查反應板等。

1.3 檢測方法

1.3.1 標準曲線的可靠性試驗：依據2015 版《中國藥典》中的方法展開各項操作：取1 支CSE，加入800μLBET 水，振蕩15 分鐘取適量后采用BET 水進行稀釋，即為3 個濃度1.0、0.1、0.01 EU/ mL 等，同時需要設定對應的陰性對照管。同時需要另外取得KCA（動態顯色法）試劑，加入BET 水，準確測量0.35 mL，使得樣品能夠得到充分的溶解，最終取得上述CSE 系列濃度溶液25μL，置入反應板上面，之后借助KCA 進行測定，測定吸光度值后繪制對應的標準曲線圖，得出相關性系數，即為r。

1.3.2 干擾試驗（供試品）：供試品溶液的稀釋倍數不能大于最大稀釋倍數，隨后將4 個樣品的溶液濃度分別記錄為G1、G2、G3 及G4。

1.4 供試品細菌內毒素限值。細菌內毒素限值的測定公式即為L=K/M，其中K 即為每人每kg 體質量在1h 內可耐受的細菌內毒素劑量最大值。按照2015 年《中國藥典》中的規定 得出，因為藥物選用的途徑差異，為積極保證藥物安全性，L 值即為所得出的計算值的二分之一到三分之一。其中清開靈注射液的L=2.0 EU/ mL，復方半邊蓮注射液的L=5.0 EU/ mL，茵梔黃注射液的L=3.0 EU/ mL，雙黃連注射液的L=1.0 EU/ mL。

2 結果

2.1 4 種清熱解毒類中藥注射液的細菌內毒素限值。依據公式L=K/M 得出，具體結果表1 所述。

表1 4 種清熱解毒類中藥注射液的細菌內毒素限值

2.2 4 種清熱解毒類中藥注射液使用KCA 檢測的干擾試驗結果，見表2。

表2 KCA 檢測的干擾試驗結果

2.3 回收率。經過KCA 檢測之后，得出各供試品溶液與細菌內毒素量的平均回收率為120%。參考標準曲線得出的回歸方程得出各供試品溶液與細菌內毒素量，同時測定回收率（R），若無干擾濃度，且回收率即為50%-200%以內，證實KCA 的檢測效果好。

3 討論

中藥注射液的成分相對復雜，且顏色比較深，大量研究表明，體外檢測方法針對部分中藥注射液品種不適用，或者均是檢測方法十分的復雜，需要多種試劑方可完成試驗。中草藥注射劑的均需要進行提取、精制，且工藝相對復雜，流程較長，容易引入一定量的熱原，中國藥典1995 年版中針對各種藥品標準尤其是小針劑中草藥注射劑未作出準確的熱原檢查項，部分品種即便能夠進行熱原檢查項，但是均使用的是家兔檢查法，費用成本較高，且整個操作的時間較長，步驟十分的繁瑣，試驗結果的準確性較差，不能夠做到標準化，大部分制藥廠及醫院均無開展此檢查[3]。

確定細菌內毒素限值主要是為了保證被檢物品安全性，同時也是為了判斷產品是否合格，因此，準確計算細菌內毒素限值對用藥安全具有積極的意義。但是，家兔劑量相對于人用最大劑量高10 倍，若按照家兔劑量得出細菌內毒素限值，必然會損失大量的產品內毒素，且操作要求特別嚴格，導致大部分合格產品最終被判斷為不合格，同時也會增加藥品生產成本[4]。

通過查閱文獻得出，FDA 標準從1993 年開始借助人用最大劑量得出細菌內毒素限值。干擾初篩試驗作為一種預試驗，主要目的是為了評價樣品濃度針對TAL 和內毒素凝集反應之間的干擾程度和干擾性質，初步篩選后檢查樣品濃度范圍是否被干擾，進一步分析相應TAL 靈敏度的干擾情況，進而為干擾試驗提供一定的參考依據，避免造成TAL 的大量損失[5]。動態顯色法的反應時間對數和細菌內毒素濃度對數呈現一定的反比關系，是一種內毒素定量檢測的體外分析試驗。該方法檢測靈敏度相對較高，且檢測范圍較寬，結果相對準確[6-7]。相對于家兔法具有較為明顯的優勢。源于家兔法在進行清熱解毒類中藥注射劑的熱原檢查時因為藥物自身的清熱作用會造成結果的假陰性，加上藥物清熱作用會導致家兔熱原反應的體溫逐漸升高，進而使得試驗結果造成一定的影響，假陰性的幾率明顯升高，導致清熱解毒類中藥注射劑的用藥安全受到不同程度的影響[8-10]。

綜合上述研究顯示，使用動態顯色法可對進一步檢測4種中藥注射液中的細菌內毒素，且干擾試驗結果穩定可靠，操作簡單方便，干擾回收率高，值得實驗室深究。