子宮頸鱗狀上皮內病變中Stathmin表達及其與預后的關系

揭由坤，葉 璐，屈曉輝，莊德葆，于曉紅

子宮頸癌作為常見的女性生殖系統惡性腫瘤，嚴重威脅著女性的生命健康。子宮頸鱗狀上皮內病變(cervical intraepithelial neoplasi, CIN)是子宮頸癌的癌前病變狀態，它包括低級別鱗狀上皮內病變(CIN1)和高級別鱗狀上皮內病變(CIN2和CIN3)。子宮頸癌是由CIN發展而來，隨著防癌篩查的普及推廣，CIN的檢出有利于減少子宮頸癌的發生。一旦CIN被檢出，那么臨床醫師會根據病變的程度及患者的個體情況采取不同的對應措施，以阻止病變的進展，因此對CIN的檢出和認識非常重要。本文采用免疫組化EliVision兩步法檢測CIN及正常子宮頸組織中Stathmin蛋白的表達，分析其與CIN分級及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 材料隨機抽取2010～2019年江西省婦幼保健院病理科存檔的子宮頸病變組織150例(其中CIN1、CIN2、CIN3各50例)，子宮頸鱗狀細胞癌30例，正常子宮頸組織30例。

1.2 組織芯片制作所有組織均經10%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋及HE染色。設計6×12點陣的芯片，合計72個位點，另加1個點做定位。利用打孔儀器對受體蠟塊進行打孔，對供體蠟塊的HE切片進行閱片，在供體蠟塊上相應的病灶部位準確標記所需要的靶點并鉆取，孔徑大小與受體蠟塊鉆孔徑一致，制成陣列蠟塊。將制成的陣列蠟塊面朝下放入金屬包埋盒中，灌蠟并輕壓蠟塊使組織芯片排平，待冷卻后放入65 ℃烤箱內維持45 min；最后將蠟塊從烤箱內拿出，待其冷卻。

1.3 免疫組化采用免疫組化EliVision兩步法進行檢測。兔抗人Stathmin多克隆抗體工作液購自福州邁新公司。免疫組化試劑盒及DAB顯色液，均購自北京中杉金橋公司，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。用已知陽性切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。病變部位上皮全層或下2/3層細胞胞質呈棕褐色顆粒為陽性，其余為陰性。

1.4 隨訪通過電話對150例CIN患者進行隨訪。

1.5 統計學分析采用SPSS 20.1軟件進行統計學分析。采用χ2檢驗、Spearman秩相關系數等方法進行分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CIN中Stathmin的表達Stathmin在CIN中的表達定位于細胞質。Stathmin在正常子宮頸組織中陽性率為0(0/30)，在CIN1中陽性率為6%(3/50)(圖1)，在CIN2中陽性率為18%(9/50)，在CIN3中陽性率為98%(49/50)(圖2)。本組結果顯示：Stathmin在CIN3中陽性率明顯高于其他組，差異有統計學意義(P<0.05，表1)，CIN2與CIN1之間表達差異無統計學意義(P=0.065)。

表1 CIN中Stathmin的表達

2.2 Stathmin與CIN復發的相關性本實驗對CIN患者進行隨訪，隨訪時間1～9年，復發時間6～75個月。結果顯示：Stathmin陽性組的復發率為54.10%(33/61)，Stathmin陰性組的復發率為3.37%(3/89)。經Spearman分析顯示，Stathmin表達與CIN復發呈正相關(P<0.05，rs=0.563，表2)。

表2 Stathmin表達與CIN復發的相關性

圖1 Stathmin在CIN1中呈陰性，EliVision兩步法 圖2 Stathmin在CIN3中呈陽性，EliVision兩步法

3 討論

Stathmin位于染色體1P36.11，是相對分子質量為1.9×104的蛋白質，廣泛存在于細胞質中。Stathmin蛋白由3部分構成：結構調節域(N端)、中心區和蛋白相互作用結構域(C端)。由于其在多種惡性腫瘤中均有高表達，因此又稱之為原癌基因蛋白-18(Op18)或Stathmin1。它亦屬于微管相關蛋白(microtubulE-associated proteins, MAP)，調節微管的解聚，又稱為微管不穩定蛋白。去磷酸化的Stathmin與微管結合成T2S復合體，當Stathmin不斷磷酸化則抑制T2S的結合，促進微管的解聚，影響紡錘體的形成，進而影響有絲分裂[1]。Stathmin可以與多種蛋白相結合，從而參與信號傳導通路的調節，參與細胞的生存、增殖、分化和運動等。如參與MAPK和p53/p21通路[1]、Stathmin-Wnt/β-catenin通路[2]、還有PI3K通路[2]等。

Stathmin第一次被發現于倉鼠的胰島素瘤實驗中[3]，隨后被證實與人類的多種惡性腫瘤相關。很多研究表明，在多種惡性腫瘤中Stathmin均有高表達。王峰等[4]認為，Stathmin基因及其蛋白在食管鱗癌中的表達明顯高于癌旁不典型增生組織及正常食管黏膜組織，且與食管鱗癌的分化程度、淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度及TNM分期顯著相關。Han等[5]通過ELISA、qRT-PCR、Western blot等多種實驗方法，經體內外實驗證實食管鱗癌中Stathmin呈過表達，且其可能通過整合素α5β1/FAK/ERK通路，參與腫瘤的轉移、侵襲。Zhang等[6]認為Stathmin基因及蛋白在喉部鱗狀細胞癌中的表達明顯高于正常喉部組織，在分期更高的腫瘤組織中的表達高于低分期的腫瘤組織，并且與頸部淋巴結轉移有關。Jeon等[7]應用免疫組化法檢測胃癌中Stathmin表達與淋巴結轉移、脈管侵犯、TMN分期呈正相關，與無復發生存率呈負相關。體外實驗中，利用siRNA進行Stathmin基因敲除后，發現低分化胃癌細胞的增殖、轉移和侵襲能力顯著下降。Hissong等[8]通過免疫組化技術發現，Stathmin1在肛門高級別上皮內病變中的表達高于低級別上皮內病變及正常肛門組織，且特異性較強，敏感性稍弱，可以與其他標志物聯合使用對肛門上皮內病變進行診斷。Shu等[9]發現Stathmin基因沉默后，可通過AKT/sCLU和STAT3信號來抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲。本實驗發現，在CIN2+CIN3組中Stathmin陽性率高于CIN1組及正常對照組，并且其在CIN3中的陽性率高于CIN2，且差異有統計學意義。雖然p16的免疫組化檢測已作為CIN檢測的輔助診斷手段[10]，但仍有一些不足之處。本實驗結果提示Stathmin的表達在CIN中亦與病變程度相關，提示其可與p16共同作為CIN3診斷的輔助指標。

Stathmin不僅在多種腫瘤中高表達，還參與腫瘤的預后。Zhao等[11]通過免疫組化技術對94例骨肉瘤中Stathmin1的表達進行檢測，通過Kaplan-Meier單因素分析、Cox回歸模型等統計學分析，發現Stathmin1高表達與腫瘤的轉移、分期及腫瘤大小相關，并且Stathmin1高表達是骨肉瘤預后差的獨立因素，且與腫瘤對化療反應差呈正相關。Wu等[12]通過免疫組化技術檢測頭頸部鱗狀細胞癌中Stathmin1蛋白的表達，發現Stathmin1過表達與腫瘤的整體生存率下降相關，并與PD-1、B7H3、B7H4等免疫抑制因子表達有關。他們認為Stathmin1是頭頸部鱗狀細胞癌預后及免疫抑制的相關因素。Zhang等[13]通過Meta分析回顧25篇文章4 625例患者，總結發現在實性腫瘤中，Stathmin1高表達與腫瘤的總生存率下降相關。Mao等[14]通過Meta分析在總結5 335例患者也得出相同結論，認為Stathmin1是臨床預后有用的生物學標志物。本實驗結果提示，Stathmin在CIN復發組中的表達高于未復發組，且其表達與CIN復發呈正相關(rs=0.563，P<0.05)；提示Stathmin是CIN的預后因素。Dundr等[15]在黑色素細胞病變的研究中卻不支持Stathmin作為預后因子的觀點，他們檢測黑色素細胞病變(包括黑色素痣、原發性黑色素瘤和轉移性黑色素瘤)中的Stathmin表達，發現其在黑色素細胞病變中與預后無相關性，但認為其在臨床實驗中是很有前景的靶向治療標志物。Liu等[16]通過建立慢病毒干擾載體及控制載體pLV3-si-Stathmin和pLV3-NC，轉染控制U373和U87-MG膠質母細胞瘤細胞。發現下調Stathmin水平，膠質母細胞瘤細胞的增殖、遷移被抑制，腫瘤細胞大都停留在G2/M期，但并未有顯著的細胞凋亡。裸鼠成瘤實驗亦顯示Stathmin下調，裸鼠成瘤延遲，腫瘤形成率及生長速度均下降；提示Stathmin是膠質母細胞瘤的靶向治療基因。同時，由于與微管的穩定有關，Stathmin還影響著腫瘤藥物的耐藥性。Biaoxue等[17]通過總結5年的文獻資料，發現高表達的Stathmin與腫瘤化療藥物的耐藥有關。在許多實體腫瘤，如非小細胞肺癌、食管鱗癌、乳腺癌、胃癌、結直腸癌及子宮內膜癌等，Stathmin高表達均與紫杉醇、長春新堿等化療藥物的耐藥有關，若降低或敲除Stathmin的表達，則腫瘤對化療藥的反應會有所恢復。所以，在很多腫瘤中Stathmin靶向治療如果與化療藥物聯合運用，或許能取得更好的療效。本實驗對子宮頸鱗狀細胞癌中Stathmin的表達亦進行了檢測，Stathmin在30例子宮頸鱗狀細胞癌中均有表達，但是其是否能成為子宮頸鱗狀細胞癌治療的靶點，則需加大樣本量及進一步實驗加以證明。

綜上所述，不同級別CIN組織中Stathmin表達有顯著差異，尤其是在CIN3組中Stathmin的表達或許有一定的輔助診斷價值。Stathmin表達還與CIN復發之間呈正相關，因此Stathmin有望成為CIN的預后指標。