外周血細胞FISH快速檢測反應體系的分析

劉玲玲，李貴喜，李三華，張紹敏，劉文弟，齊 華

熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是一種通過帶有熒光標記的核苷酸片段，經過變性、復性結合到目的基因片段上，用以獲得目的基因信息狀態的技術。自20世紀80年代中后期建立以來[1]，該技術得到了飛速發展，架起了細胞遺傳學和分子生物學的橋梁，在血液病、產前診斷和乳腺癌、膀胱癌、子宮頸癌等實體腫瘤的臨床診斷和治療監測中發揮重要作用[2]。盡管相對于其他診斷方法，FISH具有諸多優勢如：熒光試劑和探針經濟、安全，探針穩定，一次標記后可在2年內使用且實驗周期短、迅速得到結果、特異性好、定位準確，但是傳統FISH仍需要過夜雜交(>16 h)以促使熒光信號能夠達到判讀標準[3-6]。

目前，用于檢測血液病染色體異常的FISH仍然以傳統過夜雜交體系為主，不能滿足外周血細胞的快速診斷需求。因此，本科室對適用于快速檢測外周血細胞的FISH體系進行分析，取得良好效果現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗材料 人外周血細胞樣本由河南賽諾特生物公司醫學檢驗所提供。

1.1.2試劑 甲酰胺(2665C106，AMRESCO公司)；硫酸葡聚糖(109A036，Solarbio公司)；NaCl(20170824，國藥集團化學試劑公司)；丙三醇(20170113，國藥集團化學試劑公司)；SDS(BB05BA0026，BBI公司)；Cot-1 DNA(15279-101，Invitrogen公司)；碳酸乙烯酯(E26258，Sigma公司)；DAPI(20140725，Solarbio公司)。FISH探針：CEP 7/7q探針由河南賽諾特生物公司提供。

1.1.3儀器 雜交儀(CNT200，深圳賽諾特生物公司)；恒溫水浴鍋(北京永光明醫療儀器廠)；熒光顯微鏡(寧波舜宇公司)。

1.2 方法

1.2.1探針制備 (1)雜交緩沖液配制：緩沖液F(20%甲酰胺，10%硫酸葡聚糖，0.9%NaCl)；緩沖液G(20%丙三醇，10%硫酸葡聚糖，0.9%NaCl)；50%甲酰胺緩沖液(50%甲酰胺，10%硫酸葡聚糖，0.1%SDS，2×SSC)；碳酸乙烯酯緩沖液(20%硫酸葡聚糖，15%碳酸乙烯酯，600 mmol/L NaCl，10 mmol/L檸檬酸，pH 6.2)。(2)雜交探針配制：將紅色探針、綠色探針、Cot-1 DNA和雜交緩沖液按1 ∶1 ∶1 ∶7的比例配制后混勻離心備用。

1.2.2外周血細胞樣本制備 (1)將2～3 mL外周血(肝素鈉抗凝)細胞樣本放置于離心機中2 000 r/min離心5 min，棄上清；(2)向細胞懸液中加入10 mL的低滲緩沖液輕柔吹打混勻，靜置2 min，37 ℃恒溫水浴15～20 min，然后加入固定液(冰乙酸 ∶甲醇為1 ∶3，現配現用)1 mL輕柔吹打混勻，室溫預固定10 min；(3)離心5 min，棄上清，加入5 mL固定液，吹打混勻，-20 ℃沉淀30 min以上；(4)樣本于-20 ℃儲存，10天內使用完畢。制片(細胞滴片)：取制備好的10 μL細胞樣本懸液滴加-20 ℃預冷的載玻片，室溫晾干，在倒置顯微鏡下觀察細胞密度，并用新鮮配制固定液調節細胞密度，要求單視野細胞數量在100～200個為宜。

1.2.3FISH實驗 將制備完成的細胞片于60 ℃烤20～30 min，2×SSC中浸泡5 min，然后向雜交區域加入10 μL配好的探針，加蓋玻片(20 mm×20 mm)，封片膠封固。于雜交儀上進行變性和雜交。雜交完成后去除封片膠并移去蓋玻片，于73 ℃預熱的0.3%NP 40/1×SSC溶液中孵育2 min，室溫0.1%NP40/2×SSC中處理2 min，使用75%、85%、95%乙醇各依次處理1 min后室溫晾干，加10 μL 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復染液，室溫10 min后鏡下觀察分析結果。

1.2.4熒光顯微鏡圖像分析 用熒光顯微鏡在DAPI視野下定位，并采用激發波長為496 nm、發散波長為520 nm觀察，并采集綠色熒光信號；采用激發波長為551 nm、發散波長為572 nm觀察，并采集紅色熒光信號；最后DAPI、綠色熒光信號、紅色熒光信號圖像疊加合并成組合圖像。通過AxioVisionRel 4.8軟件分析圖像，評估探針雜交情況。

2 結果

2.1 雜交緩沖液對外周血細胞樣本快速雜交FISH的影響分別使用緩沖液F、緩沖液G、50%甲酰胺緩沖液、碳酸乙烯酯緩沖液和FISH探針CEP 7/7q配制成工作液。采用血液細胞滴片，通過雜交儀95 ℃變性2 min，55 ℃雜交3 h進行FISH實驗。

本實驗顯示：在相同雜交時間下，碳酸乙烯酯緩沖液FISH探針信號清晰明亮，能夠輕松判讀結果；緩沖液F和緩沖液G的FISH探針紅色和綠色信號亮度均較弱；雖然50%甲酰胺緩沖液FISH探針紅色信號亮度稍強，但綠色信號亮度較弱；緩沖液F、緩沖液G和50%甲酰胺緩沖液FISH探針信號亮度，均不能滿足結果判讀的要求(圖1)。因此，與其他雜交緩沖液相比，碳酸乙烯酯緩沖液效果更佳。

圖1 不同雜交緩沖液FISH檢測：A.緩沖液F；B.緩沖液G；C.50%甲酰胺緩沖液；D.碳酸乙烯酯緩沖液

2.2 雜交溫度對外周血細胞樣本快速雜交FISH的影響本實驗分別設置不同雜交溫度(50、53、55、57和60 ℃)進行FISH實驗分析最佳雜交溫度。實驗結果表明：在相同雜交時間下，雜交溫度為55 ℃時，FISH探針紅色和綠色信號亮度最強。雜交溫度從50～55 ℃時，FISH探針紅色和綠色信號亮度逐漸增強；雜交溫度從55～60 ℃時，FISH探針紅色和綠色信號亮度依次減弱(圖2)。因此，55 ℃是外周血細胞樣本最佳快速雜交溫度。

2.3 雜交時間對外周血細胞樣本快速雜交FISH的影響為了確定外周血細胞樣本FISH快速雜交的最佳時間，作者采用碳酸乙烯酯緩沖液、CEP 7/7q探針，在55 ℃條件下分別設置1、2、3和4 h的雜交時間進行FISH實驗。結果顯示：在相同雜交溫度條件下，雜交3 h的FISH探針紅色和綠色信號亮度最強。當雜交1、2和3 h的FISH探針紅色和綠色信號亮度逐漸增強，但當雜交時間繼續延長為4 h后FISH探針紅色和綠色信號亮度出現降低(圖3)。因此，外周血細胞樣本FISH快速雜交的最佳時間為3 h。

②A②B②C②D②E③A③B③C③D圖2 不同雜交溫度FISH檢測:CEP7/7q探針經95℃變性2min后,分別經50℃(A)、53℃(B)、55℃(C)、57℃(D)、60℃(E)雜交3h 圖3 不同雜交時間FISH檢測:CEP7/7q探針經95℃變性2min后,55℃分別雜交1h(A)、2h(B)、3h(C)、4h(D)

2.4 變性溫度對血液細胞樣本快速雜交FISH的影響FISH實驗通常需要對目的DNA和探針進行變性處理，以促進雜交過程的進行。為了探究變性溫度是否會對雜交結果產生影響和確立最佳變性溫度，實驗分別設置80、85、90和95 ℃為變性溫度進行FISH實驗。結果顯示，在雜交溫度和時間相同條件下，90 ℃變性2 min的FISH探針信號亮度和特異性最佳。變性溫度分別為80、85和90 ℃時FISH探針信號亮度依次增強(綠色信號尤為明顯)，變性溫度為95 ℃時FISH探針信號特異性降低(圖4)。因此，變性溫度過高或過低均能影響FISH探針信號的亮度和特異性，碳酸乙烯酯緩沖液條件下外周血細胞樣本的最佳變性溫度為90 ℃。

圖4 不同變性溫度FISH檢測：CEP 7/7q探針分別經80 ℃(A)、85 ℃(B)、90 ℃(C)和95 ℃(D)變性2 min后，經55 ℃雜交3 h

3 討論

染色體異常包括染色體擴增、缺失、重排等是引起血液病的重要發病機制。FISH通過帶有熒光標記的核苷酸片段，能夠監測細胞染色體和基因組，從而獲得目的基因的信息狀態，因此已成為血液病精準診斷和微小殘留監測及預后評估不可或缺的工具。目前，國內無論是外周血細胞樣本還是石蠟包埋組織樣本，為促進探針和目的核酸分子的充分雜交，達到富集探針信號的目的，FISH診斷的實驗體系仍為過夜雜交的傳統FISH操作流程。對于外周血細胞樣本，前期樣本處理簡單迅速，無需石蠟包埋、切片及長時間烤片等繁雜的處理過程，而傳統過夜雜交FISH實驗體系耗時久，效率低下，不能滿足當天出具檢驗報告的要求，是限制對外周血細胞染色體異常情況做出快速診斷的主要步驟。因此，有必要探討適用于快速檢測外周血染色體異常的FISH體系，以滿足國內臨床診斷需求。

在核酸分子雜交過程中，通常SSC充當維持鹽離子平衡的角色，不同濃度的甲酰胺(或其他化合物如碳酸乙烯酯)能夠降低探針Tm值，硫酸葡聚糖能夠促進分子雜交。若甲酰胺濃度較低則探針Tm值較高，難以實現核酸分子有效雜交，如緩沖液F；若硫酸葡聚糖濃度較低則核酸分子雜交效率低下，如50%甲酰胺緩沖液和緩沖液F；然而，碳酸乙烯酯緩沖液具有相對較高的硫酸葡聚糖和較適合的Tm值促進分子雜交。采用碳酸乙烯酯緩沖液分別設置不同變性、雜交溫度和雜交時間，以確定最佳變性溫度、雜交溫度和雜交時間。本組結果顯示變性溫度≥90 ℃探針信號亮度進入平臺期；雜交溫度為55 ℃時探針信號亮度達到頂峰，>55 ℃或<55 ℃時探針信號亮度均降低；雜交時間為3 h時探針信號亮度達到頂峰，>3 h時探針信號亮度反而降低，推測可能與雜交緩沖液特性有關。

本實驗FISH快速檢測體系適用性強，效率高，可用于替代傳統FISH檢測用于臨床診斷，縮短檢測周期。此外，本實驗結果顯示，變性溫度>90 ℃時雖然FISH探針信號亮度未受太大影響，但探針信號特異性出現降低，提示在外周血細胞樣本FISH快速檢測實驗時不宜采用過高的變性溫度。