尖吻蝮蛇毒抑瘤組分I通過PERK/eIF2α通路誘導Tca8113細胞凋亡的機制研究*

王振杰，柴 琳，徐 冉，張根葆，3

（皖南醫學院 1病理生理學教研室，2口腔醫學院，3蛇毒蛇傷研究所，安徽蕪湖241001）

口腔鱗癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，多數為舌鱗癌[1-2]。舌部血運豐富導致舌鱗癌細胞生長快，浸潤性強，易轉移[3]。雖然舌鱗癌的治療方法在不斷發展，但患者的5年生存率僅為55%左右[4]，且各種治療方法都有不同程度的不良反應。因此，尋求一種安全、高效、廉價的治療方式對舌鱗癌患者具有重要的意義。

蛇毒為我國豐富的天然藥用資源，具有降壓、鎮痛、抗炎、抗血栓、抗腫瘤等作用[5]，其中的抗腫瘤作用仍是目前研究的熱點。尖吻蝮蛇毒抑瘤組分I（anti-tumor component I fromAgkistrodon acutusvenom，AAVC-I）是由皖南醫學院蛇毒蛇傷研究所利用蛋白分離純化技術從皖南尖吻蝮蛇毒中提取的一種活性成分[6]，對肺癌、白血病等[7-10]多種腫瘤細胞具有抑制增殖和促進凋亡的作用。但AAVC-I具體是如何誘導腫瘤細胞凋亡目前尚未完全明確。內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）介導的細胞凋亡途徑是近些年發現的一種獨立于死亡受體和線粒體途徑的新凋亡通路[11-12]，而其中的蛋白激酶R樣內質網激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）/真核翻譯起始因子 2α（eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α）通路最為關鍵。因此，本實驗基于ERS相關的PERK/eIF2α通路探討AAVC-I對人舌鱗癌Tca8113細胞凋亡的影響，為尋找蛇毒抗腫瘤作用靶點的臨床應用提供實驗依據。

材料和方法

1 細胞

人舌鱗癌Tca8113細胞于2014年10月購自江蘇凱基生物技術股份有限公司，由皖南醫學院病理生理學教研室凍存保留。

2 主要藥品試劑

胎牛血清（廣州鴻泉生物科技有限公司，批號：180809）；DMEM 高糖細胞培養液（Gibco，批號：8118392）；0.25%胰蛋白酶溶液（批號：J150003）和PBS（批號：NAG1434）購自 HyClone；AAVC-I（皖南醫學院蛇毒蛇傷研究所提供）；MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（編號：C0009）、HE染色試劑盒（編號：C0105）和BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型，編號：P0010S）均購自碧云天生物技術有限公司；4%組織細胞固定液（合肥睿捷生物科技有限公司，批號：7J21BL014）；annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒（上海貝博生物科技有限公司，批號：BB19061）；RIPA組織/細胞裂解液（北京索萊寶科技有限公司，批號：20180809）；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒（編號：BL522A）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠蛋白上樣緩沖液（5×，編號：BL502A）和聚偏二氟乙烯膜（編號：BSPVDF-45）均購自 BioSharp；PageRuler? Prestained Protein Ladder（ThermoFisher，批號：00505780）；Ⅰ抗[葡萄糖調節蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）兔單克隆抗體（貨號：3177T）、p-PERK兔單克隆抗體（貨號：3179S）、p-eIF2α兔單克隆抗體（貨號：3398T）、活化轉錄因子4（activating transcription factor 4，ATF4）兔單克隆抗體（貨號：11815S）、CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancerbinding protein homologous protein，CHOP）兔單克隆抗體（貨號：5554T）、Bax兔單克隆抗體（貨號：5023T）、Bcl-2兔單克隆抗體（貨號：4223T）和GAPDH兔單克隆抗體，貨號：4970T）]和Ⅱ抗（辣根過氧物酶標記的山羊抗兔IgG，貨號：7074P2）均購自 Cell Signaling Technology；ImmobilonTMWestern Chemiluminescent HRP Substrate（Millipore，批號 ：1722101）。

3 主要實驗儀器

CO2細胞培養箱（Thermo Fisher，型號：311）；酶標儀（Tecan Austria GmbH，型號：Sunrise）；流式細胞儀（BD，型號：FACSVerse）；電泳和轉模系統（Bio-Rad，型號：PowerPacTMBasic）；凝膠成像儀（Bio-Rad，型號：Universal Hood II）。

4 實驗方法

4.1 細胞培養 在5%CO2、37℃恒溫恒濕的細胞培養箱中用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液培養Tca8113細胞，取對數生長期細胞進行實驗。

4.2 MTT法檢測AAVC-I對Tca8113細胞活力的影響 取對數生長期的Tca8113細胞，經胰蛋白酶消化離心去上清后，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液制備細胞懸液，調整細胞濃度為1×107/L。按每孔200 μL細胞懸液的量均勻接種到96孔細胞培養板中，然后將其于細胞培養箱中培養24 h。待細胞貼壁后，去除孔內原有培養液，加入100 μL含10%胎牛血清和不同濃度（2.0、4.0、8.0、16.0和24.0 mg/L）AAVC-I的DMEM高糖培養液，同時設置空白對照（blank control）組和正常對照（normal control）組，每組各6個復孔，將其繼續于培養箱內培養24 h后向每孔內加入10 μL濃度為5 g/L的MTT，再于培養箱內繼續孵育4 h。4 h后再向每孔內加入100 μL的formazan溶解液，適當混勻。最后在培養箱內繼續孵育至formazan全部溶解，于酶標儀570 nm波長測定每孔吸光度（A）并計算細胞生長抑制率（inhibitory rate，IR）。公式如下：IR（%）=[1-（藥物濃度組平均A值-空白對照組平均A值）/（正常對照組平均A值-空白對照組平均A值）]×100%。

4.3 HE染色觀察AAVC-I對Tca8113細胞形態的影響 收集對數生長期的Tca8113細胞制備細胞懸液，調整細胞濃度為2×107/L。按每孔3 mL細胞懸液的量將細胞均勻接種到6孔細胞培養板中，于細胞培養箱中培養24 h。待細胞貼壁后，去除孔內原有培養液，每孔加入3 mL含10%胎牛血清和不同濃度AAVC-I的DMEM高糖培養液，同時設置正常對照組；繼續培養24 h后取出培養板，吸棄孔內培養液，用PBS液輕輕清洗每孔2遍，加入4%組織細胞固定液2 mL固定細胞30 min；去除固定液，用PBS清洗每孔2遍，加入1 mL蘇木素染液染色5 min；吸去蘇木素染液并用單蒸水流水沖洗每孔2 min；向每孔加入1 mL伊紅染液染色1 min；單蒸水流水沖洗每孔1 min；最后于倒置顯微鏡下鏡檢拍照。

4.4 annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡 密度為2×107/L的對數生長期Tca8113細胞懸液按每孔3 mL接種到6孔板中。培養24 h細胞貼壁后去除孔內原有培養液并加入實驗濃度的AAVC-I，每孔3 mL，同時設置正常對照組繼續培養24 h；收集每孔上清液中的細胞和胰酶消化的貼壁細胞于相對應10 mL離心管中，4℃、500×g離心5 min，棄上清；用預冷的PBS洗滌細胞沉淀，再4℃、300×g離心5 min，棄上清液，每支離心管加入400 μL的annexin V結合液（1×）重懸細胞；每支離心管加入5 μL的FITC染色液，輕輕混勻，于4℃避光條件下孵育15 min；每支離心管再加入10 μL的PI染色液，輕輕混勻，于4℃避光條件下孵育5 min；最后用流式細胞術檢測細胞凋亡，使用FlowJo 10.0.7軟件分析細胞凋亡情況。

4.5 Western blot法檢測相關蛋白的表達量 取密度為2×107/L的對數生長期Tca8113細胞懸液按每孔3 mL接種到6孔板中。24 h細胞貼壁后去除孔內原有培養液并加入實驗濃度的AAVC-I，每孔3 mL，同時設置正常對照組繼續培養24 h；吸去孔內培養液加入冷PBS液輕輕清洗每孔2遍，清洗后再向每孔加入RIPA細胞裂解液（含1%的PMSF）200 μL；把6孔板置于冰上輕輕刮下孔內細胞使其與細胞裂解液充分接觸。待細胞充分裂解后收集孔內總蛋白液于1.5 mL離心管內，4℃、12 000×g離心5 min；收集離心管內總蛋白上清液于新的1.5 mL離心管內，并用BCA法測定總蛋白濃度，然后加入相應量的5×蛋白上樣緩沖液，沸水中煮10 min使蛋白充分變性。取相同質量變性后的總蛋白液行SDS-PAGE分離；然后把凝膠中的蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜上；轉膜后用5%的牛血清白蛋白室溫下對膜進行封閉1.5 h；對封閉完成的膜于4℃搖床上孵育Ⅰ抗過夜，Ⅰ抗孵育結束后用TBST液洗膜3次（每次5 min）；加入Ⅱ抗室溫孵育1 h，Ⅱ抗孵育結束后再次用TBST洗膜3次（每次5 min）；在膜上滴加化學發光劑于凝膠成像儀上曝光顯影；最后利用圖像分析軟件Image Lab 5.2.1對條帶進行分析。

5 統計學處理

實驗數據使用SPSS 20.0統計軟件處理，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示，多組間比較差異比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著性差異t檢驗（LSD-t），以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 AAVC-I對Tca8113細胞活力的抑制作用

不同濃度的AAVC-I處理Tca8113細胞24 h，MTT法檢測結果顯示，隨著AAVC-I濃度（2.0、4.0、8.0、16.0和24.0 mg/L）的增加，細胞抑制率逐漸升高，AAVC-I各濃度組與正常對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.01），見表1。AAVC-I處理Tca8113細胞24 h的IC50為17.69 mg/L（圖1），故選擇4.0、8.0和16.0 mg/L作為AAVC-I的實驗濃度。

2 AAVC-I對Tca8113細胞形態的影響

實驗濃度的AAVC-I作用Tca8113細胞24 h，對細胞進行HE染色可以明顯觀察到細胞的形態變化。正常對照組細胞的胞核經蘇木素染成藍紫色，胞質經伊紅染成粉紅色，細胞飽滿呈良好的貼壁生長狀態，形態多為梭形或不規則多邊形；隨著AAVC-I實驗濃度的增加，實驗組細胞逐漸皺縮變小，細胞間隙增大，其中AAVC-I（16 mg/L）組大部分細胞胞膜消失，僅看到染色加深呈固縮狀態的胞核，并且出現大量的細胞碎片和凋亡小體，見圖2。

表1 AAVC-I對Tca8113細胞活力的影響Table 1.Inhibitory effect of AAVC-I on viability of Tca8113 cells（Mean±SD.n=6）

Figure 1.Inhibitory effect of AAVC-I on viability of Tca8113 cells.圖1 AAVC-I對Tca8113細胞活力的影響

Figure 2.Effects of AAVC-I on morphological changes of Tca8113 cells（HE staining）.圖2 AAVC-I對Tca8113細胞形態的影響

3 AAVC-I對Tca8113細胞凋亡的影響

實驗濃度的AAVC-I處理Tca8113細胞24 h后，用annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡情況，結果顯示，正常對照組細胞凋亡率為（2.27±0.36）%，AAVC-I（4.0 mg/L）組凋亡率為（11.04±2.03）%，AAVC-I（8.0 mg/L）組凋亡率為（18.71±0.71）%，AAVC-I（16.0 mg/L）組凋亡率為（35.50±2.26）%，AAVC-I各濃度組的細胞凋亡率較正常對照組顯著升高（P＜0.05），且各濃度組的細胞凋亡率之間差異也具有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

4 AAVC-I對Tca8113細胞相關蛋白表達的影響

實驗濃度的AAVC-I處理Tca8113細胞24 h后，Western blot法檢測了ERS相關蛋白GRP78、PERK/eIF2α通路中的p-PERK和p-eIF2α、PERK/eIF2α通路下游的ATF4和CHOP，以及細胞凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2的表達水平，結果顯示，與對照組相比，AAVC-I各濃度組 GRP78、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP和Bax表達上調，Bcl-2表達下調（P＜0.05），且AAVC-I各濃度組的蛋白表達水平之間的差異同樣具有統計學意義（P＜0.05），見圖4～6。

討 論

臨床治療腫瘤以誘導腫瘤細胞凋亡為有效策略之一[13]，其中，細胞凋亡實驗是一種評價和篩選抗腫瘤藥物快捷有效的方法[14]。ERS介導的細胞凋亡是近年來抗腫瘤藥物研發的重要靶點[15]。研究表明，ERS介導的細胞凋亡通路是促進人白血病細胞、人肝癌細胞、人肺癌細胞等多種腫瘤細胞凋亡的有效途徑[16-18]。本實驗室基于ERS相關的PERK/eIF2α信號通路，進一步研究AAVC-I促人舌鱗癌Tca8113細胞凋亡的機制。

Figure 3.Effect of AAVC-I on apoptosis of Tca8113 cells.The apoptosis of the Tca8113 cells treated with AAVC-I for 24 h was detected by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs AAVC-I（4.0 mg/L）group；△P＜0.05 vs AAVC-I（8.0 mg/L）group.圖3 AAVC-I對Tca8113細胞凋亡的影響

Figure 4.The protein levels of GRP78，p-PERK and p-eIF2α in Tca8113 cells treated with different concentrations of AAVC-I.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs AAVC-I（4.0 mg/L）group；△P＜0.05 vs AAVC-I（8.0 mg/L）group.圖4 AAVC-I對Tca8113細胞GRP78、p-PERK和p-eIF2α蛋白水平的影響

Figure 5.The protein expression levels of ATF4 and CHOP in Tca8113 cells treated with different concentrations of AAVC-I.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs AAVC-I（4.0 mg/L）group；△P＜0.05 vs AAVC-I（8.0 mg/L）group.圖5 AAVC-I對Tca8113細胞ATF4和CHOP蛋白表達水平的影響

Figure 6.The protein expression levels of Bax and Bcl-2 in Tca8113 cells treated with different concentrations of AAVC-I.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs AAVC-I（4.0 mg/L）group；△P＜0.05 vs AAVC-I（8.0 mg/L）group.圖6 AAVC-I對Tca8113細胞Bax和Bcl-2蛋白表達水平的影響

本實驗首先應用MTT法檢測不同濃度的AAVCI對人舌鱗癌Tca8113細胞活力的抑制作用。結果顯示，在AAVC-I處理Tca8113細胞24 h后，隨著濃度的增加，AAVC-I對細胞活力的抑制作用逐漸增強；另外，根據IC50值確定AAVC-I的合適實驗濃度，繼續作用細胞24 h，HE染色結果可以直接觀察到細胞凋亡的形態學變化。在AAVC-I作用肺癌、白血病等[7-10]腫瘤細胞的既往研究表明，AAVC-I在抑制腫瘤細胞增殖的同時也誘導細胞的凋亡，與本文結果一致，且本實驗采用annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡水平的結果進一步顯示了AAVC-I誘導Tca8113細胞凋亡的作用呈劑量依賴性。相關文獻報道，細胞凋亡主要是由于抗凋亡蛋白與促凋亡蛋白的平衡失衡而導致的，其中Bcl-2蛋白家族在當中起著重要作用[19-21]。我們應用Western blot檢測顯示，在AAVC-I誘導細胞發生凋亡時促凋亡蛋白Bax的表達水平升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平降低。有研究證實，在ERS誘導細胞凋亡的過程中，過表達的CHOP蛋白會引起Bcl-2蛋白家族的失衡而導致細胞凋亡[22-23]。本實驗結果也顯示，隨著AAVC-I濃度的增加，細胞凋亡率逐漸上升，CHOP蛋白的表達水平也隨之升高。在這一過程中，當AAVC-I誘導細胞發生凋亡時，我們又進一步檢測了ERS標志性蛋白GRP78的表達量，結果顯示其表達水平亦升高。有研究發現，ERS標志性蛋白GRP78在細胞發生ERS時表達量顯著增加，進而減緩ERS對細胞的損傷，同時GRP78與內質網跨膜蛋白PERK解離，導致PERK蛋白激活自身磷酸化，磷酸化的PERK會進一步導致eIF2α蛋白磷酸化以抑制蛋白質的合成，從而減少錯誤折疊蛋白在內質網的聚集，有助于恢復內質網穩態[24-25]。本實驗同樣觀察到AAVC-I各濃度組的磷酸化PERK和磷酸化eIF2α蛋白水平均高于正常對照組，同時ATF4蛋白水平也升高。ATF4蛋白是ERS相關的PERK/eIF2α通路下游重要的轉錄因子，持續ERS時磷酸化的eIF2α蛋白會導致ATF4蛋白合成大量增加并與CHOP基因啟動子結合使CHOP蛋白大量表達，最終引起細胞凋亡[26-27]。國內外研究表明，敲除CHOP基因和在缺氧條件下發生的ERS中沉默PERK基因，均可顯著抑制細胞凋亡[28-29]。這進一步佐證了本研究的結果。

在之前的蛇毒抗腫瘤研究中，我們只是針對蛇毒抗腫瘤效應進行簡單研究分析[7-10]，而本實驗在蛇毒抗腫瘤效應的基礎上進一步探討其誘導凋亡的機制，表明AAVC-I在誘導人舌鱗癌Tca8113細胞凋亡時ERS相關的PERK/eIF2α通路發揮著重要作用，這為蛇毒抗腫瘤的機制提供了實驗依據。但還需注意的是，由于蛇毒成分復雜，純化技術難度大，蛇毒促腫瘤細胞凋亡的ERS相關PERK/eIF2α通路機制是否與其它促凋亡機制之間存在聯系等問題還有待深入研究。

同時，細胞系作為體外模型而被廣泛應用于生物醫學研究。不同細胞系之間可能存在交叉污染，其中最為常見的是多種細胞系受到HeLa細胞污染[30-32]，而本研究中所用到的人舌鱗癌Tca8113細胞也不能排除受到HeLa細胞的污染[33]，但本教研室對蛇毒抗多種腫瘤細胞的大量研究證實，蛇毒抑制腫瘤細胞增殖及促進凋亡的作用是值得肯定的。