前列腺素E1通過抑制內質網應激保護心肌梗死后大鼠的心臟*

饒蘭蘭，馬添翼

（中南大學湘雅醫學院附屬?？卺t院 1藥學部，2心血管內科，海南?？?70208）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是嚴重危害全球人們身體健康的最常見的疾病之一[1]。MI能造成心肌細胞損失（包含凋亡、壞死和其他類型死亡造成的細胞數減少），而梗死區殘存的心肌細胞則受到MI后心力衰竭的進一步損傷[2]。心肌細胞死亡的增加和心肌間質纖維化的加重是MI后心室重構和心功能減退的重要原因[3]，因此保護心肌細胞免受MI后繼續損傷和抑制MI后心肌間質纖維化的加重，有望提高MI后心功能并抑制慢性心力衰竭的進展。

內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）誘導的死亡途徑不同于死亡受體途徑（外源性途徑）和線粒體介導的死亡途徑（內源性途徑）[4]，因此內質網也被認為是決定細胞死亡的重要細胞器。當細胞面對缺氧、缺血和鈣代謝紊亂等刺激時可導致未折疊的蛋白的積累，引發內質網未折疊蛋白反應以維持細胞穩態和功能穩定性，若ERS反應過度延長或過于嚴重，則會導致細胞發生凋亡[5]。ERS介導的細胞凋亡涉及3種信號通路：C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）、caspase-12和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun NH2-terminal kinase，JNK）。此外，作為內質網的伴侶蛋白，葡萄糖調節蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）在ERS動態平衡的調節中也起著關鍵作用，也是ERS的標志[6]。最近研究發現，ERS參與心血管疾病的病理發展過程，減少由ERS導致的心肌細胞損傷和心室重構可提高MI后的心功能[4，7]。

前列腺素E1（prostaglandin E1，PGE1）也稱前列地爾，因為具有多種藥理活性如血管擴張、抑制白細胞黏附和血小板聚集、改善血液流變學特性、抗炎等，所以已被廣泛用于治療外周血管疾病、潰瘍、肝病、肺動脈高壓、缺血性心臟病等[8-10]。近期研究中，PGE1被證明在缺血再灌注肝損傷動物模型中可誘導 GRP78的表達[6]，這提示 PGE1具有調節 ERS作用。然而，PGE1對MI后心室重構中的作用尚不清楚。因此，本研究利用冠脈左前降支結扎法建立大鼠MI模型，觀察PGE1是否對MI后的心臟具有保護作用，并進一步探討其機制。

材料和方法

1 實驗動物

50只5 周齡雄性SPF級SD大鼠（130～140 g）購自南方醫科大學動物實驗中心[SCXK（粵）2016-0041]，飼養于海南省藥物研究所[SYXK（瓊）2014-0025]SPF級動物房內。大鼠正常飲食、飲水。飼養環境為室溫、57%濕度、采用12 h光/暗循環。

2 實驗試劑

蘇木素-伊紅（HE）染料、戊巴比妥鈉、TUNEL試劑盒、RIPA裂解液和BCA試劑盒購自江蘇碧云天生物科技公司；Masson三色染色試劑盒購自北京索萊寶科技公司；PGE1（前列地爾注射液，北京泰德制藥股份有限公司生產）購自本院門診藥房；同型IgG II抗和Triton X-100均購自Invitrogen；5%牛血清白蛋白購自 Sigma；抗 GRP78、CHOP、caspase-12、Bcl-2、Bax、caspase-3和cleaved caspase-3抗體以及HRP標記的II抗購自Santa Cruz。

3 實驗方法

3.1 實驗分組與動物模型的建立 50只SD大鼠適應性飼養1周后，10只分入假手術（sham）組，20只分入模型（model）組，20只分入model+PGE1組。參考文獻[11]描述，把大鼠固定在手術臺上，通過腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）對大鼠進行麻醉，并予以插管和呼吸器泵通氣，打開大鼠胸腔以暴露心臟，用縫線將冠狀動脈左前降支從肺動脈圓錐結扎到左心耳，然后依次關閉胸腔，心電圖顯示ST段抬高證實構建MI大鼠模型成功。假手術組除不進行冠脈結扎外，其它手術方式與模型組相同。模型+PGE1組大鼠在冠脈結扎造模術后第1～7天，每天通過每只大鼠經尾靜脈注射2 μg/kg的PGE1（注：術后第1天注射時間為術后4 h）。假手術組和模型組在假手術或冠脈結扎造模術后第1～7天，每天經尾靜脈注射等量的生理鹽水。所有大鼠繼續飼養8周。

3.2 超聲心動圖對大鼠心功能的分析 8周后，使用Sonos 7500超聲儀（Philips）記錄大鼠仰臥時的超聲心動圖圖像。通過觀察大鼠心尖四腔的二維聲波圖像，記錄左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）、左心室舒張末期內徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD）和心輸出量（cardiac output，CO）并進行數據分析。

3.3 TTC染色 8周后，每組任取5只大鼠，麻醉后，處死各組的大鼠并取出心臟，放入-80℃速凍10 min后，沿長軸連續切5片厚度為2 mm的心肌切片。心肌切片用1%TTC溶液在37℃條件下染色10 min，隨后用4%多聚甲醛固定24 h，拍照，并用ImageJ軟件計算梗死面積。

3.4 組織形態學分析 8周后，麻醉處死各組剩余的大鼠并取出心臟，分離左心室組織。左心室組織分成兩部分，一部分直接凍存在-80℃（用于后續Western blot檢測），另一部分固定在4%多聚甲醛24 h，并包埋在石蠟中進行組織學研究。石蠟包埋組織被切成厚約5 μm的切片，分別予以HE和Masson染色，觀察心肌組織的形態。

3.5 TUNEL法檢測 按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書步驟對各組左心室心肌組織石蠟切片進行染色并在熒光顯微鏡下觀察，并計數病變區域或sham組同位置的TUNEL染色陽性（綠色熒光）細胞。

3.6 免疫組化染色 使用常規的免疫組織化學方法對各組左心室心肌組織石蠟切片分別進行GRP78，CHOP、caspase-12、Bcl-2、Bax和 cleaved caspase-3的免疫組織化學染色。上述I抗均為兔單克隆抗體，稀釋比例分別為1∶150（抗CHOP抗體）、1∶200（抗GRP78抗體）、1∶300（抗caspase-12抗體）、1∶400（抗Bcl-2抗體和抗Bax抗體）和1∶100（抗cleaved caspase-3抗體）。然后使用蘇木精進行核復染。從每個樣品中隨機選擇病變區域或sham組同位置的的5個區域進行觀察，并用ImageJ軟件對目的蛋白表達進行半定量分析。

3.7 Western blot檢測蛋白水平 取各組左心室心肌組織并利用RIPA裂解液萃取細胞蛋白。然后采用BCA法將各組蛋白樣品定量至相同濃度后，取20 μg樣品蛋白進行SDS-PAGE、轉膜和封閉。封閉后以1∶1 000的稀釋比例孵育I抗（caspase-12、CHOP、GRP78、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3 和 GAPDH 抗體），4℃過夜。次日用TBST洗滌后再室溫孵育相應的HRP標記的II抗1 h，最后洗滌后利用化學發光成像儀顯影。以GAPDH為內參照，采用ImageJ軟件分析目的條帶相對表達。

4 統計學處理

實驗數據均采用均數±標準差（mean±SD）表示，并利用GraphPad Prism軟件進行后續統計學分析。多組定量資料的兩兩比較，采用單因素方差分析事后Bonferroni檢驗。當P＜0.05時為差異具有統計學意義。

結 果

1 各組大鼠的入組情況

因sham組無大鼠死亡，故sham組納入10只大鼠；model組在術后第1、2、3、5和9天各發生1、2、1、3和1只大鼠死亡，故僅納入12只大鼠；model+PGE1組在術后第3、4和8天各發生1、1和2只大鼠死亡，故納入16只大鼠。

2 PGE1提高MI后的大鼠心功能

術后8周，通過超聲儀分別檢測各組大鼠的心功能，結果顯示，與sham組相比，model組大鼠的LVEF、LVFS和CO顯著降低，而LVEDD顯著升高（均P＜0.01）；與 model組相比，model+PGE1組大鼠的LVEF、LVFS和CO顯著升高（P＜0.01或P＜0.05），LVEDD顯著降低（P＜0.01），見圖1。以上結果提示PGE1可提高MI后大鼠的心功能。

3 PGE1降低MI后的小鼠心肌梗死和病理形態學改變

通過HE和Masson染色觀察心肌組織病理學改變，結果顯示，sham組大鼠左心室區域心肌細胞形狀規則，心肌纖維排列整齊，心肌間質間未見明顯的炎性細胞浸潤（圖2A），也未見明顯的膠原沉積（圖2B）；model組大鼠左心室區域梗死區和非梗死區邊界清晰，梗死區炎性細胞浸潤，心肌細胞形態不規則，心肌條紋紊亂或消失（圖2A），出現心肌間質纖維化和大量膠原沉積（圖2B）；model+PGE1組大鼠左心室區域梗死區和非梗死區邊界清晰（但梗死區較?。?，梗死區炎性細胞浸潤較model組輕，心肌細胞形狀和心肌纖維排列也趨向正常（圖2A），梗死區心肌間質纖維化和膠原沉積也較model組輕（圖2B）。對Masson染色陽性區面積統計顯示，與sham組相比，model組大鼠的心肌Masson染色陽性面積顯著增大（P＜0.01）；與model組相比，model+PGE1組心肌Masson染色陽性面積顯著減?。≒＜0.01），見圖2B。TTC染色結果顯示，與sham組相比，model組大鼠的心肌梗死面積顯著增大（P＜0.01）；與model組相比，model+PGE1組心肌梗死面積顯著減?。≒＜0.01），見圖2C。

4 PGE1減輕MI后的心肌損傷

Figure 1.Effect of PGE1 on the cardiac function parameters after MI in rats.LEVF：left ventricular ejection fraction；LEFS：left ventricular fractional shortening；LVEDD：left ventricular end-diastolic dimension；CO：cardiac output.Mean±SD.n=10 in sham group；n=12 in model group；n=16 in model+PGE1 group.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs model group.圖1 PGE1對MI后大鼠心功能參數的影響

Figure 2.Effect of PGE1 on the pathological changes and the infarct size of cardiac tissues after MI in rats.A：representative images of HE staining（scale bar=50 μm）；B：representative images of Masson staining（scale bar=50 μm）and quantitative results of Masson staining-positive size；C：representative images of TTC staining（scale in millimeters）and quantitative results of infarct size in cardiac tissues.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01vs model group.圖2 PGE1對MI后大鼠心肌組織病理改變和梗死灶大小的影響

TUNEL法結果顯示，與sham組同位置心肌切片相比，model組大鼠心肌切片的病變區的TUNEL陽性細胞數量顯著增加（P＜0.01）；與model組相比，model+PGE1組大鼠心肌切片的病變區的TUNEL陽性細胞數量顯著降低（P＜0.01），見圖3A。免疫組化染色觀察結果顯示，sham組同位置心肌組織Bcl-2呈中陽性，Bax呈弱陽性，cleaved caspase-3呈陰性表達；model組病變區心肌組織Bcl-2呈陰性，Bax和cleaved caspase-3呈強陽性彌散表達；model+PGE1組病變區心肌組織Bcl-2呈強陽性彌散表達，Bax和cleaved caspase-3呈中陽性表達，見圖3B。進一步用ImageJ軟件量化免疫組化染色圖中蛋白表達結果顯示，與sham組同位置心肌組織相比，model組病變區心肌組織Bcl-2表達顯著降低、Bax和cleaved caspase-3表達顯著增加（P＜0.01）；與model組病變區心肌組織相比，model+PGE1組病變區心肌組織Bcl-2表達顯著增加、Bax和cleaved caspase-3表達顯著降低（P＜0.01），見圖 3B。Western blot結果顯示，與sham組相比，Model組心肌組織Bcl-2表達顯著降低、Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平顯著增加（P＜0.01）；與 model組相比，model+PGE1組心肌組織Bcl-2表達顯著增加、Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平顯著降低（P＜0.01），見圖3C。

Figure 3.Effect of PGE1 on myocardial damage after MI in rats.A：the representative images of cardiac tissues with TUNEL staining（scale bar=100 μm）and the quantitative results of TUNEL-positive cells；B：the representative images of immunohistochemical staining（scale bar=100 μm）for Bcl-2，Bax and cleaved caspase-3 in cardiac tissues and the quantitative results；C：the representative Western blot images and quantitative results of the protein levels of Bcl-2，Bax and cleaved caspase-3.Mean±SD.n=5 in sham group；n=7 in model group；n=9 in model+PGE1 group.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs model group.圖3 PGE1對MI后大鼠心肌損傷的影響

5 PGE1抑制MI后的內質網應激水平

通過免疫組化和Western blot法檢測ERS標志分子GRP78、CHOP和caspase-12的表達水平來評價PGE1對ERS的影響。免疫組化染色觀察結果顯示，sham組同位置心肌組織的caspase-12、CHOP和GRP78呈陰性表達；model組病變區心肌組織的caspase-12、CHOP和GRP78呈強陽性彌散表達；model+PGE1組病變區心肌組織的caspase-12、CHOP和GRP78呈中陽性表達，見圖4A。進一步用ImageJ軟件量化免疫組化染色圖中蛋白表達結果顯示，與sham組同位置心肌組織相比，model組病變區心肌組織caspase-12、CHOP和GRP78的表達顯著增加（P＜0.01）；與model組相比，model+PGE1組病變區心肌組織caspase-12、CHOP和GRP78的表達顯著減少（P＜0.01），見圖4A。Western blot結果顯示，與sham組相比，model組心肌組織caspase-12、CHOP和GRP78的表達顯著增加（P＜0.01）；與model組相比，model+PGE1組心肌組織caspase-12、CHOP和GRP78的表達顯著減少（P＜0.01），見圖4B。

Figure 4.Effect of PGE1 on the ERS level of cardiac tissues after MI in rats.A：the representative images of immunohistochemical staining（scale bar=100 μm）for caspase-12，CHOP and GRP78 in cardiac tissues and the quantitative results；B：the representative Western blot images and quantitative results of the expression levels of caspase-12，CHOP and GRP78.Mean±SD.n=5 in sham group；n=7 in model group；n=9 in model+PGE1 group.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs model group.圖4 PGE1對MI后大鼠心肌組織ERS水平的影響

討 論

缺氧、氧化應激、炎癥反應等各種刺激均是MI引發ERS的常見激活因素[5]。本研究顯示冠脈結扎8周后心肌組織的CHOP、GRP78和caspase-12表達顯著升高，表明MI 8周后存在心肌組織ERS的激活。有證據表明，在MI 4周后心肌細胞GRP78和CHOP開始顯著升高，伴隨 caspase-3 的激活[4，7]。由于 caspase-3的激活參與線粒體介導、死亡受體和ERS誘導的死亡途徑，因此cleaved caspase-3被認為是細胞死亡的標志。MI后的心力衰竭可誘導ERS，而ERS過度反應又進一步促進心肌細胞cleaved caspase-3的表達，進一步加重心力衰竭的發展[4，7，12]。本研究結果顯示，MI 8周后心肌細胞死亡增多，心肌組織促凋亡因子Bax和凋亡標志物cleaved caspase-3表達升高，抑凋亡因子Bcl-2表達降低，心肌梗死面積的擴大。

PGE1因具有擴張血管、抑制血小板聚集、保護細胞等作用，被廣泛應用于腦血管疾病及循環系統、呼吸系統和外周血管疾病的治療。最近研究發現，PGE1可通過降低內質網分子伴侶CHOP和GRP78的表達抑制ERS誘導的細胞凋亡[6]。本研究結果顯示，PGE1能抑制MI大鼠的GRP78、CHOP和caspase-12表達升高，提示PGE1能顯著降低MI后的ERS水平；且PGE1能抑制Bax表達和促進Bcl-2表達，降低caspase-3的活化，減少MI后心肌細胞死亡的數量。另外，MI后心功能減退不僅與心肌細胞損失相關，還與心肌間質的膠原沉積和炎性因子浸潤相關；膠原過度沉積能導致心肌間質組織纖維化，降低心功能；炎性因子浸潤不僅能促使心肌細胞死亡，還能加重MI后心力衰竭的發展[13-14]。ERS的過度激活能增加MI后炎性因子浸潤和膠原異常增生[4，7]。本研究結果顯示，PGE1能減少MI 8周后膠原過量沉積，減輕炎癥反應，并減緩心功能的降低。結合以上實驗結果推測，PGE1可能通過抑制MI后ERS的激活，隨之抑制心肌細胞死亡、膠原異常增生和炎癥，最終提高MI后的心功能。

綜上所述，PGE1可減緩MI后慢性心力衰竭的進展，其機制可能是其通過抑制MI后心肌ERS的激活，進而減少膠原過量沉積、炎性浸潤和心肌細胞死亡并提高MI后的心功能。