TL1A通過調控IL-17和IFN-γ促進慢性實驗性結腸炎相關腸纖維化的發生*

尹鳳榮， 戰蓉蓉， 王 冬，宋 佳，李 輝，張 紅，張曉嵐

（河北醫科大學第二醫院消化內科，河北省消化病重點實驗室，河北省消化病研究所，河北石家莊050035）

腸纖維化是炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）的嚴重并發癥，持續的炎癥反應可引起腸道黏膜反復損傷、修復，最終導致瘢痕形成及腸壁纖維化，腸腔狹窄或梗阻以及膿腫等并發癥，嚴重影響著患者生活質量。而炎癥性腸病導致腸纖維化的機制尚未完全明確，并且目前的主要治療藥物仍然缺乏能夠有效抑制或逆轉腸纖維化的方法。腸纖維化的發生是一個復雜、動態的過程，目前認為是在易感基因基礎上出現了腸黏膜免疫失衡，釋放多種炎癥因子和生長因子激活腸道間質細胞進而產生膠原等細胞外間質（extracellular matrix，ECM）成分過度沉積，最終導致腸纖維化[1]。

作為腸道炎癥反應的中心環節，CD4+T細胞在調控體內免疫應答和維持免疫平衡穩定中發揮重要作用，其中，輔助性T細胞（T helper cells，Th）又包含Th1、Th2及Th17等3種細胞亞群。Th1細胞主要分泌干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ），而Th17細胞主要分泌白細胞介素17（interleukin-17，IL-17）。腫瘤壞死因子樣配體1A（tumor necrosis factor ligand-related molecule 1A，TL1A）可通過影響腸黏膜T細胞的活化、增殖，促進Th1細胞的極化及效應功能，上調IFN-γ的表達，從而促進腸黏膜的炎癥反應和纖維化的發生[2，4]。同時，TL1A還可作用于 Th17細胞使其分泌IL-17增加，導致腸黏膜免疫失調引發腸道炎癥反應，而慢性炎癥反應是腸纖維化發生的首發因素，炎癥反應可進一步激活腸成纖維細胞的活化，產生大量ECM，以致腸纖維化的形成。因此，TL1A可能通過調控IL-17和IFN-γ促進慢性實驗性結腸炎相關腸纖維化的發生。

材料和方法

1 實驗動物

野生型C57BL/6小鼠，體重20～22 g，8～10周齡，清潔級，由河北醫科大學實驗動物中心提供（合格證編號為911102）。TL1A過表達的轉基因（LCK-CD2-TL1A-transgenic）小鼠，體重20～22 g，8～10周齡，清潔級，種鼠由美國Cedars-Sinai醫學中心IBD與免疫生物學研究中心贈予，后期由我方在層流動物實驗室飼養繁殖并進行鑒定。

2 主要試劑及儀器

髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；ELISA試劑盒購于聯科生物技術有限公司；抗CD4、IL-17和IFN-γ抗體及同型對照抗體購自BD。FACSAriaⅡ流式細胞分選儀購自碧迪醫療器械（上海）有限公司；FV12-IXCOV激光共聚焦顯微鏡購自OLYMPUS。

3 方法

3.1 動物模型的建立與實驗分組 將轉基因（transgene，Tg）小鼠與 C57BL/6野生型（wild type，WT）小鼠隨機分為DSS/WT組、DSS/Tg組、control/WT組和control/Tg組，每組6只。Control組給予飲用蒸餾水，DSS組給予間斷飲用2%DSS，分別為第1～5天、第8～12天、第15～19天、第22～26天、第27和28天，其余時間均飲用蒸餾水，第29天先應用乙醚麻醉小鼠，然后斷頸處死小鼠。

3.2 疾病活動指數（disease activity index，DAI） 每天觀察小鼠的進食情況、體重變化、大便的性狀、精神狀態、毛發光澤程度和活動情況等。以DAI評分的標準，見表1，評估小鼠的糞便性狀，每日的體重及大便潛血情況，并記錄評分。

表1 DAI評分的標準Table 1.The DAI scoring criteria

3.3 結腸炎癥程度評估 采用HE染色觀察結腸組織學損傷，并參照Cooper等[5]評分標準，見表2進行。MPO檢測試劑盒檢測結腸組織MPO活性。

3.4 分離并提取腸黏膜固有層單個核細胞（lamina propria mononuclear cells，LPMC）及脾臟和腸系膜淋巴結（mesenteric lymph nodes，MLN）單個核細胞

3.4.1 分離提取脾臟單個核細胞 無菌環境中鈍性分離脾臟，迅速放入裝有RPMI-1640完全培養基（2 mL）的培養皿，用1 mL注射器內芯底部研磨脾臟。用70 μm尼龍細胞濾網濾過細胞，應用28 mLRPMI-1640完全培養基于研磨過程中沖洗細胞濾網和培養皿，最終慮至50 mL離心管。20℃、3 000 r/min離心細胞懸液10 min。棄去上清，加入2 mL紅細胞裂解液，重懸細胞，常溫靜置2 min，加入10 mL RPMI-1640完全培養基，20℃、3 000 r/min離心細胞懸液10 min。棄去上清，加入2 mL RPMI-1640完全培養基重懸細胞，計數細胞并調整濃度為2×109/L。

表2 結腸組織病理學的Cooper評分標準Table 2.Colon histopathology scoring criteria by Cooper

3.4.2 分離提取MLN單個核細胞 無菌環境中鈍性分離MLN，迅速放入裝有RPMI-1640完全培養基（2 mL）的培養皿，用1 mL注射器內芯底部研磨MLN。用70 μm尼龍細胞濾網濾過細胞，用8 mL RPMI-1640完全培養基于研磨過程中沖洗細胞濾網和培養皿，最終慮至50 mL離心管，20℃、3 000 r/min離心細胞懸液10 min。棄去上清，加入2 mL RPMI-1640完全培養基重懸細胞，并計數細胞，并調整濃度為2×109/L。

3.4.3 分離提取LPMC 無菌環境取出結腸，置于放有冰冷1×PBS的培養皿中；應用20 mL注射器反復沖洗腸腔糞便，移入新的放有冰冷1×PBS的培養皿中，進一步清除殘余脂肪組織和腸系膜。在無菌通風操作臺中，移入新的放有冰冷1×PBS的培養皿中，縱向剪開腸管，轉入放有有1×HBSS的培養皿中，把腸管切成長3～4 cm的小段。組織移入放有20 mL預消化液的50 mL試管，放入37℃恒溫箱，低轉速（40×g）孵育20 min，孵育過程中需劇烈旋轉3次，孵育完畢棄去預消化液，應用1×HBSS沖洗2次。組織移入放有1～2mL消化液的培養皿上，用刀片快速切剁成大小約1 mm×1 mm×1 mm的碎塊組織。組織移入新的50 mL離心管中，加入10 mL消化液，放入37℃恒溫箱，低轉速（40×g）孵育20 min，孵育過程中需劇烈旋轉3次。用70μm細胞濾網濾過細胞懸液至新的50 mL試管中，加入20 mL RPMI-1640完全培養基，此時細胞懸液總量30 mL。2 000 r/min離心細胞懸液5 min，小心棄去上清，1 mL 42%Percoll溶液重懸沉淀，混勻后再加入4 mL 42%Percoll溶液。用5 mL注射器輕輕把3 mL 75%Percoll溶液于細胞液底部輕輕加入，形成分界液面。2 000 r/min，離心42%/75%Percoll梯度液20 min，離心后，兩種不同Percoll液交界面上可形成LPMCs白環。界面下為破碎紅細胞形成的紅環，底層為死細胞和小片狀顆粒，最上面一層為上皮細胞。用1 mL移液槍于交界面LPMCs白環處小心收集單個核細胞2 mL，移入14 mL試管，加入RPMI-1640完全培養基至總體積10 mL，2 000 r/min 離心，5 min，小心棄去上清，用 500 μL RPMI-1640完全培養基重懸細胞，計數調整細胞濃度為2×109/L。

3.4.4 ELISA 將96孔板用濃度為0.5 mg/L的anti-CD3e包被2 h，再以2 mg/L的anti-CD28包被，各組取125 μL的2×109/L LPMC加入每孔中。將接種好的細胞在5%CO2、37℃條件下在細胞培養箱中培養48 h，然后取上清，采用ELISA法檢測，操作按試劑盒說明書進行。

3.5 流式細胞術 分離并提取脾臟和MLN單個核細胞，調整濃度為1×109/L。將單核淋巴細胞數調整濃度為1×109/L；各取1 mL，加入Cell Activation Cocktail 2 μL，37℃避光培養 4 h；CD16/32 1 μL 封閉，4℃、5 min；加CD4抗體室溫孵育30 min，PBS清洗后加Perm/Wash，4℃、500×g離心5 min，棄上清，重復1次；最后應用100 μL Perm/Wash重懸細胞后加入抗IL-17和INF-γ抗體，渦旋混勻，4℃避光孵育40～50 min；加入Perm/Wash清洗，樣本流式管中分別加入500 μL的PBS重懸細胞，上機檢測。

3.6 Masson染色 包埋的結腸組織以4 μm的厚度連續切片，按以下步驟進行染色：二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫蠟至水，自來水沖洗1 min，蘇木精4 min，充分水洗，酸性麗春紅品紅10 min，充分水洗，1%磷鉬酸3 min，2%苯胺藍1 min，0.2%冰醋酸片刻，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光鏡下觀察腸組織的纖維化程度，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，對結果進行定量分析，結果以平均吸光度表示。

3.7 天狼星紅染色 石蠟包埋的結腸組織以4 μm的厚度連續切片，按以下步驟進行染色：二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫蠟至水，自來水沖洗1 min，天青石藍15 min，蒸餾水充分沖洗，天狼星紅飽和苦昧酸染液10 min，蒸餾水充分沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光鏡下觀察腸組織的纖維化程度，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對結果進行定量分析，結果以平均吸光度表示。

4 統計學處理

統計分析采用SPSS 18.0軟件，以均數±標準差（mean±SD）表示計量資料數據，多組間采用單因素方差分析（one-way ANOVA）比較，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 TL1A促進小鼠慢性實驗性結腸炎相關腸纖維化的發生

與WT+DSS組相比，Tg+DSS組小鼠的DAI評分升高更加顯著（P＜0.05），見圖1A。TL1A加重病理學炎癥程，通過光鏡下觀察小鼠結腸組織HE染色，可見正常組小鼠的結腸黏膜上皮保持完整，且上皮、固有層、黏膜肌層構成的腺體均排列整齊；野生型小鼠中，與control組相比，DSS組小鼠的結腸可見黏膜缺失，淺潰瘍形成，腺體被破壞或消失，杯狀細胞可見減少，黏膜及黏膜下層可見水腫，并可見中性粒細胞及淋巴細胞浸潤，病理評分進一步升高P＜0.05），見圖1C、D；MPO活性更高（P＜0.05），見圖1B。

馬松染色和天狼星紅染色觀察結腸膠原沉積的結果顯示，與DSS/WT組相比，DSS/Tg組的腸道纖維化程度更重（P＜0.05），見圖1E、F。

2 TL1A上調CD4+IFN-γ+和CD4+IL-17+T細胞的比例

免疫熒光染色法測定顯示，與DSS/WT組小鼠相比，DSS/Tg組小鼠的結腸組織中CD4+IFN-γ+和CD4+IL-17+T細胞的平均吸光度升高[IFN-γ：（115.428±13.933）U/gvs（94.562±17.030）U/g，P＜0.05；IL-17：（126.426±15.939）U/gvs（84.528±11.967）U/g，P＜0.05]，見圖2。流式細胞術檢測結果顯示，MLN單個核淋巴細胞中CD4+IFN-γ+、CD4+IL-17+T細胞數的百分比明顯升高（CD4+IFN-γ+：8.04%±0.44%vs6.71%±0.26%，P＜0.05；CD4+IL-17+：5.61%±0.19%vs2.47%±0.28%，P＜0.05）；脾臟中單個核細胞中CD4+IFN-γ+和CD4+IL-17+T細胞數的百分比明顯升高（CD4+IFN-γ+：10.45%±0.66%vs7.29%±0.58%，P＜0.05；CD4+IL-17+：3.33%±0.33%vs2.10%±0.36%，P＜0.05），見圖3。

3 TL1A促進IFN-γ和IL-17的分泌

ELISA法檢測脾臟、MLN和LPMC單個核細胞分泌IFN-γ分泌水平，結果顯示，與DSS/WT組小鼠相比，DSS/Tg組小鼠的IFN-γ和分泌水平明顯升高（P＜0.05），見圖4。

討 論

目前認為，IBD相關腸纖維化的發生機制是在易感基因基礎上，大量炎癥細胞釋放促炎因子，引起腸道的慢性炎癥，使腸道持續處于損傷和修復并存的狀態[6]，導致腸壁以膠原為主的細胞外間質（extracellular matrix，ECM）在腸組織的過度合成和異常沉積，最終形成腸纖維化，表現為腸狹窄或腸梗阻等嚴重的并發癥[7-8]。

TL1A是新近發現的一種腫瘤壞死因子家族成員，是IBD的易感基因。TL1A通過與受體DR3相結合，刺激T淋巴細胞的激活，促進Th1和Th17等細胞的活化與效應功能，參與腸道炎癥反應[9-10]。在對IBD患者研究中發現，結腸LPMC的TL1A表達升高，且與炎癥的嚴重程度呈正相關[11]。有學者通過用抗TL1A抗體干預后，發現其在緩解腸道炎癥的同時減輕了纖維化程度，提示TL1A在結腸炎癥反應中發揮了促炎促纖維化作用，且可能與抑制IFBs增殖與活化，減少膠原合成的同時增加膠原分解有關[12-13]。本研究發現，飲用DSS后，與野生型小鼠相比，轉基因小鼠DAI和病理評分進一步升高，證明TL1A過表達促進了慢性實驗性結腸炎小鼠的腸道炎癥反應。通過天狼星紅染色觀察DSS誘導的小鼠結腸炎中腸道膠原纖維的改變，發現轉基因小鼠與野生型小鼠飲用DSS水后，與control組相比，結腸不僅僅出現了炎癥的改變，在黏膜及黏膜下層出現膠原蛋白的沉積，馬松染色、天狼星紅染色提示膠原染色的面積明顯增多，而且，轉基因小鼠病變程度更重。這表明TL1A在促進結腸發生炎癥的同時，也會促進膠原的合成與過度沉積，進而在腸纖維化的發生發展中發揮重要作用。

Figure 1.Establishment of DSS-induced chronic experimental colitis-associated intestinal fibrosis model.A：DAI，consisting of weight loss，stool consistency and OB，was measured daily；B：MPO activity were expressed；C：HE staining（×100）；D：Histological score；E：Masson-staining（×200）；F：Sirius red staining（×200）.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group in WT mice.圖1 成功建立DSS誘導的慢性實驗性結腸炎模型

Figure 2.Immunofluorescence detection of IFN-γ and IL-17 expression in mouse intestinal tissues（×200）.A：IFN-γ expression and the position in the intestinal tissue of the mice；B：IL-17 expression and position in the intestinal tissue of the mice.圖2 免疫熒光法檢測IFN-γ和IL-17在小鼠腸組織中的定位表達

目前，研究表明，TL1A作為調控Th細胞的關鍵因子，可促進CD4+T細胞分化為Th1細胞和Th17細胞，分泌大量的促炎因子IFN-γ和IL-17，參與IBD的發生。在T細胞轉移及DSS誘導的慢性結腸炎小鼠模型中發現，TL1A可通過上調腸相關淋巴樣組織中CD4+T細胞的IFN-γ和IL-17表達，增強Th1和Th17細胞的效應功能，促進腸黏膜炎癥和纖維化發生[14-15]，研究證實，TL1A能誘導CD患者的腸黏膜固有層CD4+T細胞分化成為Th17細胞，IL-17分泌增加加重腸道炎癥反應的發生；同時也可促進IFN-γ產生，使Th1介導的免疫反應增強[16]。研究發現纖維性CD患者的腸活檢標本IL-17的表達升高，并且在狹窄性CD患者中IL-17能刺激肌成纖維細胞產生更多的膠原[17]。因此，我們推測TL1A通過調控IL-17和IFN-γ促進慢性實驗性結腸炎相關腸纖維化的發生，參與腸纖維化的發生。

本研究通過檢測Th1和Th17細胞的百分比發現，與DSS/WT組小鼠相比，DSS/Tg組脾臟、MLN中CD4+IFN-γ+細胞和CD4+IL-17+細胞的百分比均明顯升高，同時IFN-γ和IL-17的分泌水平也明顯升高，表明TL1A通過促進Th1和Th17細胞的分化，進而分泌IFN-γ和IL-17增加，參與慢性實驗性結腸炎相關腸纖維化的發生。與此同時，我們通過免疫熒光法、流式細胞術及ELSIA，亦證實了在DSS組中轉基因小鼠與野生型小鼠相比，TL1A促進了IFN-γ和IL-17的分泌。這表明TL1A通過上調IL-17和IFN-γ的表達，促進了慢性實驗性結腸炎相關腸纖維化的發生發展。

Figure 4.The levels of IFN-γ（A～C）and IL-17（D～E）in the supernatants of mononuclear cells from spleen（A，D）and MLN（B，E）and lamina propria（LPMC；C，F）were measured by ELISA.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs DSS/WT group.圖4 ELSIA法檢測IFN-γ和IL-17在小鼠脾臟、腸系膜淋巴結和腸黏膜固有層單個核細胞上清培養液中的表達水平

綜上所述，TL1A通過調控IL-17和IFN-γ促進慢性實驗性結腸炎相關腸纖維化的發生。