靶向共價抑制劑的最新研究進展

韓王宇婧，劉順英

(華東師范大學 化學與分子工程學院，上海分子治療與新藥創制工程技術研究中心，上海 200062)

共價抑制劑是一類能夠與特定的靶蛋白共價結合，從而抑制其生物功能的小分子化合物。這些抑制劑往往都含有丙烯酰胺、β-內酰胺、磺酰氟基、環氧乙烷等官能團，能與靶蛋白中特定的氨基酸殘基，如半胱氨酸殘基、絲氨酸殘基、賴氨酸殘基、谷氨酸殘基發生化學反應，形成共價鍵，從而抑制相應蛋白的生物學功能[1]。共價抑制生物靶點的小分子藥物的發展歷史要追溯到1897年，拜耳公司研制出了阿司匹林，用于鎮痛和抗炎(圖1)。青霉素抗生素代表了1940年第二次世界大戰中使用的另一類經典共價抑制劑[2]。與非共價抑制劑相比較，共價抑制劑最重要的一個優點就是與靶蛋白的結合具有高親和性，并具有相對較長的作用時效[1]，因為共價化合物與靶點結合會比同類非共價藥物的結合牢固得多。

共價鍵抑制劑通過共價鍵與靶蛋白相互作用的原理，成就其優點的同時，也帶來了一些致命的缺點，比如因與靶點鍵合牢固，其一旦脫靶帶來的毒副作用會比非共價抑制劑更大[2]。以至于藥物發現中一度談起共價鍵抑制藥物，就避之不及。

圖1 靶向共價抑制劑的發展的重要事紀

但隨著現代藥物開發技術發展以及設計理念的更新，特別是20世紀80年代質子泵抑制劑奧美拉唑被批準上市，該藥物徹底改變了與胃酸過多有關疾病的治療方法，以及90年代抗凝血藥氯格他雷和2013年非小細胞肺癌抑制劑阿法替尼的成功上市，使得人們對共價鍵抑制劑有了重新認識：可以通過精巧的結構設計，提高共價鍵與靶點氨基酸殘基結合的選擇性，從而克服共價鍵抑制劑易于脫靶的缺點，最終開發成為服務于人們健康的藥物，特別是現代“基于結構理性設計藥物”策略的出現，共價鍵抑制劑重新獲得制藥界的廣泛關注。

此外，人們也認識到，對于一些非共價藥物難以識別或者不能識別的靶點，比如藥物的靶點是有著相同口袋的一類靶點家族成員，共價抑制劑也具有明顯的優勢。隨著共價抑制劑研發熱潮的回歸，該領域近十余年取得了眾多突破性的進展，特別是2013年第一個EGFR(表皮生長因子受體)抑制劑阿法替尼(Afatinib，1)被FDA批準上市后[3-5]，已有多篇優秀的綜述文章對相關研究進展進行了總結，如針對共價抑制劑作用的各種靶點，已有Renato A Bauer等人[6]進行了綜述；根據靶向共價抑制劑作用的各種氨基酸殘基，已有Matthias Gehringer等人[7]進行了總結；有關靶向激酶的共價抑制劑，已有Zheng Zhao等人[1]進行了綜述。本文將著重介紹2013年多個共價鍵抑制劑獲批達到共價鍵抑制研發的一個小高潮至今發展的一系列進入臨床或作用于新靶點的靶向共價抑制劑研究進展。

目前，已報道的蛋白中能與小分子共價抑制劑發生化學反應生成共價鍵的氨基酸殘基，主要共有以下四類: ①靶向半胱氨酸殘基的共價抑制劑；②靶向絲氨酸、酪氨酸和蘇氨酸殘基的共價抑制劑；③靶向賴氨酸殘基的共價抑制劑；④靶向谷氨酸和天冬氨酸殘基的共價抑制劑。本文將按照這種分類方式對2013年以來被FDA批準或進入臨床研究的代表性靶向共價抑制劑進行簡要介紹。

1 靶向半胱氨酸殘基的共價抑制劑

甲硫氨酸中的硫醚基團以及中性氨基酸中的巰基都只有中等的親核性，然而一旦它在半胱氨酸側鏈以硫醇鹽的形式存在，其親核性就增加了幾個數量級，從而成為20種常見氨基酸中親核性最強的親核試劑[7]。因此，半胱氨酸是最常見的共價氨基酸殘基，其側鏈巰基通過親核進攻藥物分子中的親電基團，從而形成共價鍵。包含缺電子基團或親電中間體例如酮類、丙烯酰胺、炔基酰胺、α-鹵代酮、炔等的化合物分子容易與半胱氨酸的巰基發生反應，形成共價鍵。這些親電基團或親電中間體常稱為親電彈頭(圖2)。

代表性的作用于半胱氨酸殘基的小分子共價抑制劑結構見圖3。阿斯利康制藥有限公司研發出的奧西替尼(Osimertinib，2)于2015年被FDA批準上市，作用靶點是EGFR，用于非小細胞肺癌的治療。前期臨床研究表明，它對EGFR的L858R突變體的抑制作用可達到12nM的水平；以及對L858R/T790M突變體抑制的IC50為1nM。奧西替尼對EGFR(L858R/T790M)突變體的抑制率比野生型的大約高出200倍[8]。此后，另一個EGFR抑制劑來那替尼(Neratinib, 3)也于2018年被批準上市[9-11]，用于治療乳腺癌等疾病?？诜种苿┮吏斕婺?Ibrutinib，4)于2013年被批準上市，作為治療B細胞惡性腫瘤藥物，它對BTK(酪氨酸激酶)有著次納摩爾的抑制活性[12-13]；2017年，BTK抑制劑艾拉替尼

圖2 作用于半胱氨酸的主要親電彈頭單元

(Acalabrutinib，5)被FDA批準上市。與第一代BTK抑制劑依魯替尼相比，艾拉替尼具有高效及高選擇性的特點[14-15]。由于它對EGFR、TEC等受體的結合能力較弱，使得它的脫靶概率很低，從而提高了它與BTK相互作用的精準性以及效率。這也大大降低了藥物的副作用與毒性。Timothy Guzi課題組于2015年報道的首例選擇性的FGFR(纖維原細胞生長因子受體)抑制劑BLU-554(6)，現在已經進入臨床研究階段[16-17]。并于 2015 年 9 月獲得了 FDA 批準的孤兒藥 (orphan drug) 稱號，成為第二代 FGFR抑制劑中第一個獲得孤兒藥批準的小分子化合物。此后，還有PRN-1371(7)、ARQ-087(8)等[18-19]，也已經被批準進入臨床研究。MEK1(分裂素活化的蛋白激酶1)在與癌癥發生有關的信號通路中的信號轉導起著關鍵的作用[20]。E6201(9)是一個低納摩爾級的MEK1共價抑制劑，在臨床試驗中用于固體瘤和銀屑病。它具有較高的血漿穩定性，從而可以用于靜脈注射或者局部給藥[21-22]。Cathepsin K(組織蛋白酶K)抑制劑奧當卡替(Odanacatib，10),現在正處于晚期臨床研究階段，可以治療疏松癥相關的骨質流失，從而減少老年婦女骨折的發生[23-24]。

圖3 代表性的作用于半胱氨酸殘基的小分子共價抑制劑結構

2 靶向絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基的共價抑制劑

絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸都含有羥基，能在生化反應中與某些化合物的親電中心發生反應從而形成共價鍵。

2.1 靶向絲氨酸殘基的共價抑制劑

代表性的作用于絲氨酸殘基的小分子共價抑制劑結構見圖4。阿維巴坦(Avibactam，11)是一個作用于β-內酰胺酶的共價抑制劑，于2015年2月被FDA批準上市，用于治療革蘭氏陰性菌感染引起的相關疾病[25-26]。它不具有β-內酰胺骨架，但是能夠通過共價作用使它的作用靶點β-內酰胺酶乙?；?。PF-04457845(12)是一個可以口服的FAAH(脂肪酸酰胺水解酶)共價抑制劑，現在已經進入臨床研究，可以用于治療慢性疼痛以及其他神經系統疾病[27-28]。

圖4 代表性的作用于絲氨酸殘基的小分子共價抑制劑結構

2.2 靶向蘇氨酸殘基的共價抑制劑

蛋白酶體是對細胞功能的調控有重要作用的一大類蛋白復合物。Salinosporamide A (13)是一個蛋白酶體抑制劑(圖5)，現在正處于臨床三期研究階段。它對NCI-H226非小細胞肺癌、SF-539 CNS癌、SK-MEL-28黑素瘤以及MDA-MB-435胸腺癌細胞的抑制活性均能達到10nM以下[29]。它分子結構中的β-內脂基團能夠與蘇氨酸殘基發生反應，從而起到抑制蛋白酶體的作用[30]。

2.3 靶向酪氨酸殘基的共價抑制劑

與半胱氨酸或者未質子化的賴氨酸相比，中性的酪氨酸殘基的固有親核性相對較弱，因此，開發出作用于酪氨酸殘基的共價抑制劑是相當具有挑戰性的，這也導致以酪氨酸殘基為作用靶點的共價藥物較少[7]。2018年4月哈佛大學報道了首例作用于SRPK1/2(絲氨酸蛋白激酶)的不可逆抑制劑SRPKIN-1(14)(圖6)[31]。在ATP鍵合口袋中，它能夠與酪氨酸的酚羥基形成共價鍵從而抑制絲氨酸蛋白激酶的活性。

圖5 代表性的作用于蘇氨酸殘基的共價抵制劑結構

3 靶向賴氨酸殘基的共價抑制劑

賴氨酸中親核性的氨基能與不可逆抑制劑作用。由于氨基在蛋白界面的pKa值大約為10.4，而生理環境的pH值大約7.4，因此在生理條件下大部分賴氨酸殘基都以質子化的形式存在，從而無法作為親核試劑。這對它在生物體中的反應帶來了一些挑戰。磷脂酰肌醇激酶(PI3K)是促進磷脂酰肌醇的肌醇環磷酸化的信號轉導酶家族中的一員，它在細胞增殖、凋亡以及細胞其他功能中起著重要的作用[6]?；衔?8的結構以及其與谷氨酸殘基結合的作用機制(圖7)。天然藥物渥曼青霉素(Wortmannin，15)就是一個PI3K抑制劑[32]，但是其穩定性及選擇性較差?？紤]到Wortmannin在與賴氨酸殘基結合時分子中的呋喃環打開，故將呋喃環用開鏈的胺替代，一個穩定的口服PI3K抑制劑PX-866(16)被開發出來，現在已進入臨床研究階段。PX-866能與PI3K催化位點上的賴氨酸殘基發生一個乙烯基轉酰胺化反應，從而不可逆的抑制PI3K激酶[33-34]。2015年紐卡斯特大學報道了首例CDK2(周期蛋白依賴性激酶)共價抑制劑NU6300(17)，可用于治療具有確定遺傳特征的腫瘤[35]。此外，蛋白質激酶的不可逆共價抑制劑大多數是以半胱氨酸的巰基作為親核基團來開發的, 而基于賴氨酸的氨基來開發的卻較為少見，NU6300的開發也對科學家們開發具有類似彈頭單元的藥物具有重要啟示。

圖7 代表性的作用于賴氨酸殘基的小分子共價抑制劑

4 靶向谷氨酸和天冬氨酸殘基的共價抑制劑

谷氨酸和天冬氨酸都含有羧基，羧基的弱親核性給共價修飾谷氨酸和天冬氨酸側鏈帶來了一定的困難[6]，這里僅介紹一例作用于谷氨酸羧基的共價抑制劑。PDEδ是磷酸二酯酶中的一個δ亞型，在維持細胞中KRAS的動力學分布中起著不可替代的作用[36]。

馬普分子生理學研究所(Max Planck Institute of Molecular Physiology)的Herbert Waldmann課題組，在2017年報道了一個作用于PDE的δ亞型上的谷氨酸殘基的共價抑制劑化合物18[37]?；衔?8分子中的N-甲基異惡唑鹽能在堿的作用下開環，形成乙烯酮酰亞胺，從而與羧基反應形成共價鍵[38]，作用機制如圖8。

圖8 化合物18的結構以及其與谷氨酸殘基結合的作用機制

本文簡單介紹了2013年小分子共價鍵抑制劑獲批為藥物的小高潮以來，共價抑制劑的發展歷史和一些有代表性的共價藥物及他們與靶點的作用機制。靶向共價抑制劑的設計是一個有前景的領域，且正處于茁壯成長的階段。與非共價抑制劑相比，共價抑制劑對靶點的作用更高效，從而能夠通過減少給藥劑量來提高治療窗口。此外，共價鍵抑制劑在減少靶點突變導致的耐藥性(drug resistance)和藥物開發過程中不需要PK藥代動力學研究等優勢，近年來在制藥界得到了重新認識和重視。但如何開發高選擇性的共價鍵抑制劑以避免脫靶效應帶來的毒副作用仍然是這一領域研究的關鍵問題。隨著現代基于結構的理性藥物設計理念以及化學生物學等新興學科、技術的發展，以及對靶點蛋白結構、性質更深入的認識，這一問題必將在不遠的將來得到有效解決。除了本文中提到的一些有代表性的靶向共價抑制劑之外，大量各種各樣的共價抑制劑正在不斷涌現；靶向共價抑制劑的開發技術也在飛速發展。我們有理由相信，靶向共價抑制劑開發必將迎來新的研發高潮，造福人類健康。