苯并咪唑酮類衍生物的合成及生物活性的初步研究

劉褚雯，易 燦，劉進兵

(邵陽學院 食品與化學工程學院，湖南 邵陽 422000)

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1,Tyrosinase)是一種含有銅離子的多酚氧化酶，廣泛分布于自然界中[1-2]。由于其具有獨特的雙重催化作用，是人體內黑色素形成的關鍵酶，黑色素的過度合成及分泌會導致多重疾病的產生，如人體皮膚色素障礙性疾病、帕金森等[3-4]。另外在農業生產中，大量的蔬菜和水果由于黑色素分泌過多而褐變被丟棄[5-6]。而目前已經上市的酪氨酸酶抑制劑如曲酸、熊果苷、氫琨等存在較大的副作用，已無法完全滿足當前的需求, 需要進一步開發高效低毒的藥物來滿足社會的需要[7-11]。

苯并咪唑類化合物是一類具有多種生物活性且結構比較簡單的氮雜環類化合物，被廣泛用于農藥、醫藥等領域[12-16]。另外本課題組前期研究發現席夫堿類化合物具有很好的酪氨酸酶抑制活性[17-18]，因此依據生物活性疊加原理，我們設計了該系列化合物(圖1), 將5-氨基苯并咪唑酮與醛兩部分拼合，以期發現高效低毒的酪氨酸酶抑制劑及抗腫瘤藥物。

圖1 苯并咪唑酮類衍生物的合成

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

WPX-4顯微熔點儀；UV -1780紫外可見分光光度計；Bruker Ascend(400M)型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內標)；美國 Biotek 公司酶標儀。

醛、5-氨基苯并咪唑酮和冰乙酸均購置于上海達瑞試劑有限公司，酪氨酸酶購置于Sigma-Aldrich公司；A549人肺癌細胞、HepG2人肝癌細胞及MCF-7人乳腺癌細胞購于中國科學院上海生命科學研究院細胞庫；RPMI-1640 培養基(Thermo公司)；胎牛血清(Hy-clone公司)；CCK-8試劑及二甲基亞砜(Amresco公司)；其他試劑均為市售分析純，未進一步純化處理。

1.2 2a～2h的合成通法[17]

將(10 mmol)5-氨基苯并咪唑酮和12 mmol 1a～1h分別加入到圓底燒瓶中，再加入20 mL無水乙醇，攪拌下緩慢滴加3滴冰乙酸，升溫至回流狀態后保溫反應，TLC跟蹤反應。待反應完成，冷卻至室溫后置于冰箱中靜置，析出大量固體，抽濾，冷的乙醇洗滌，粗產品經95%乙醇重結晶，晾干得中間產物2a～2h。

2a：黃色固體，收率90.2%；1HNMR(DMSO-d6，300 MHz)，δ13.73(s，1H，-OH)，δ10.73(s，1H，-NH)，δ10.0(s，1H，-NH)，δ10.15(s，1H，-OH)，8.75(s，1H，=CH)，7.39～7.37(d，J = 8.3Hz，1H，Ph-H)，6.94～6.93(d，J = 5.7 Hz，3H，Ph-H)，6.37～6.25(m，2H，Ph-H)；13CNMR(DMSO-d6，75 MHz)，δ 163.3，162.4，160.8，156.1，141.9，134.5，131.0，129.0，114.9，112.6，109.3，108.1，102.8，101.2。

2b：淡黃色固體，收率91.2%；1HNMR(DMSO-d6，300 MHz)，δ13.73(s，1H，-OH)，δ10.62(s，2H，-NH)，8.84(s，1H，=CH)，7.97(s，1H，Ph-H)，7.49～7.45(m，1H，Ph-H)，7.14～7.11(m，1H，Ph-H)，7.01(s，1H，Ph-H)，6.92～6.83(m，3H，Ph-H)，3.87(s，3H，-OCH3)；13CNMR(DMSO-d6，75 MHz)，δ 159.5，156.0，153.4，145.8，133.1，130.9，127.0，124.6，121.0，114.9，112.3，109.2，101.4，56.2。

2c：黃色固體，收率92%；1HNMR(DMSO-d6，300 MHz)，δ13.73 (s，1H，-OH)，δ10.58 (s，2H，-NH)，8.71(s，1H，=CH)，7.94～7.91(d，J = 8.5 Hz,1H，Ph-H)，6.90～6.88(d，J = 8.1 Hz，1H，Ph-H)，6.82～6.77(m，2H，Ph-H)，6.64～6.61(m，2H，Ph-H)，3.86(s，3H，-OCH3)，3.85(s，3H，-OCH3)；13CNMR (DMSO-d6，75 MHz)，δ 163.6，160.8，155.9，152.8，146.1，130.7，128.3，117.6，114.5，109.0，106.7，101.2，98.4，56.1，55.8。

2d：淡黃色固體，收率91.1%℃；1HNMR (DMSO-d6，300 MHz)，δ13.73(s，1H，-OH)，δ10.67(s，2H，-NH)，8.75(s，1H，=CH)，8.08～8.05(m，1H，Ph-H)，7.75～7.52(m，1H，Ph-H)，7.34～7.29(m，2H，Ph-H)，6.998～6.92(m，3H，Ph-H)；13CNMR(DMSO-d6，75 MHz)，δ 163.5，161.0，155.9，150.6，144.8，133.3，130.7，127.8，125.1，124.0，116.5，115.2，109.0，101.5。

2e：棕色固體，收率40.2%；1H NMR (DMSO-d6，300 MHz)，δ 10.72(s，1H)，10.68(s，1H)，8.64(s，1H)，7.99～7.84(m，2H)，7.58～7.45(m，3H)，6.98～6.85(m，3H)；13C NMR(DMSO-d6，500 MHz)，δ 158.67，156.27，145.32，137.05，131.66，131.10，129.43，129.23，129.07，115.39，109.34，101.80。

2f：橙色固體，收率70.2%；1H NMR (DMSO-d6，300 MHz)，δ 13.56(bs，1H)，10.80(bs，2H)，8.95(s，1H)，7.21(d，1H，J=7.5 Hz)，7.12～6.84(m，5H)，3.81(s，3H)；13C NMR(DMSO-d6，500 MHz)，δ 161.69，156.27，151.15，148.57，141.68，131.30，129.92，124.49，120.06，119.12,116.91，115.71，109.50，101.67，56.59.。

2g：黃色固體，收率80.2%；1H NMR (DMSO-d6，300 MHz)，δ 14.59(s，1H)，10.83(bs，2H)，9.07(s，1H)，7.14～7.22(m，2H)，7.10～7.07(m，2H)，7.12～6.96(m，2H)；13C NMR(DMSO-d6，500 MHz)，δ 163.01，160.03，156.19，140.84，134.63，131.41，130.53，126.16，124.10，117.80，117.48，116.00，109.68，101.67。

2h：黃色固體，收率82.2%；1H NMR ((DMSO-d6，300 MHz)，δ 13.84(s，1H)，11.27(s，1H)，11.21(s，1H)，9.36(s，1H)，8.27(s，1H)，7.93(d，1H，J=8.7 Hz)，7.39(d，1H，J=8.7 Hz)，7.51～7.32 (m，3H)；13C NMR(DMSO-d6，500 MHz)，δ 159.95，156.27，141.50，135.56，134.57，131.30，130.21，122.02，119.62，116.17，110.44，109.51，101.55，31.39。

1.3 抑制酪氨酸活性測試

采用本課題組通用的酪氨酸酶抑制活性測試方法進行[17]。

1.4 細胞培養及增殖情況檢測[19]

A549細胞接種于細胞培養皿，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640( Roswell Park Memorial Institute-1640)完全培養基，37℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中培養。

用CCK8法檢測細胞增殖情況，取對數生長期A549細胞、HepG2細胞及MCF-7細胞，以2×104cell·mL-1的濃度接種于96孔板，待細胞貼壁后，在各孔加入不同濃度(1，2，4，8，16，32，64，128，256，512，1024 ng·mL-1)的化合物2a-2j，空白對照組未加入藥物，陽性對照組加入5-氟尿嘧啶，計算2a-2j及5-氟尿嘧啶的IC50值。

2 結果與討論

2.1 合成部分

本文通過實驗合成了8個苯并咪唑類類衍生物，其收率在40.2%～92.0%之間。其中無取代的苯甲醛收率最低，為40.2%。當苯甲醛2號及4號位上被甲氧基取代時收率最高，為92.0%。由此初步推測，苯甲醛上取代基的存在提高了反應活性。

2.2 酪氨酸酶抑制活性

參照文獻，檢測所有化合物對酪氨酸酶的抑制活性，結果見表1。

表1 化合物2a～2h對酪氨酸酶抑制活性

如表1 所示，化合物2a與化合物2f具有一定的酪氨酸酶抑制活性，通過SPSS Statistics 17.0計算化合物2a和化合物2f的IC50值分別為(120.25 ± 1.06)μM和(111.17 ± 0.86)μM，與陽性對照藥物熊果苷(IC50值(102.11± 1.12)μM)相當，其他化合物的抑制酪氨酸酶活性效果都不如陽性對照藥物熊果苷，說明苯環上羥基取代可能有利于提高抑制活性，甲氧基取代基位置改變或甲氧基數目增加對抑制活性不利，這可能與甲氧基的共軛效應以及位阻效應有關。

2.3 抗腫瘤活性

表2 化合物2a～2h抗腫瘤活性

分別考察了所合成的8個化合物對A549人肺癌細胞、HepG2 人肝癌細胞及MCF-7 人乳腺癌細胞的抑制作用，結果見表2。從表2可以發現，所有化合物對A549人肺癌細胞和HepG2 人肝癌細胞均沒有明顯的抑制作用，除化合物2d外，對MCF-7 人乳腺癌細胞也沒有明顯的抑制作用。

3 結論

本文合成了8個苯并咪唑衍生物，并考察了所有目標化合物抑制酪氨酸酶活性及抗腫瘤效果。其中化合物2f抑制酪氨酸酶活性效果最好，其IC50值為(111.17 ± 0.86) μM，與陽性對照藥物熊果苷抑制活性相當；初步構效關系分析表明，羥基的位置和羥基的數目對抑制酪氨酸酶活性效果有一定的影響；另外該系列化合物對除2d對MCF-7人乳腺癌細胞有明顯抑制作用外，其他化合物對A549人肺癌細胞、HepG2 人肝癌細胞及MCF-7 人乳腺癌細胞均沒有明顯的抑制作用。這些研究成果為后續深入開展工作提供了重要參考。