NaCl脅迫對馬鈴薯試管苗POD酶活性及同工酶的影響

裴懷弟 劉潤萍 林玉紅 李淑潔 呂汰

摘要：選用4個馬鈴薯品種（系）的試管苗，在不同NaCl濃度的培養基上誘導分化成苗，對其耐鹽性進行初步研究。結果表明，隨著NaCl濃度的增加，大西洋、L03-1、L03-6的POD酶活性與無脅迫處理相比呈現下降趨勢，但L03-2與無脅迫處理相比POD酶活性呈增加趨勢。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳對NaCl脅迫馬鈴薯試管苗POD同工酶監測表明，馬鈴薯鹽誘導再生苗POD同工酶譜帶存在品種（系）間顯著差異，鹽脅迫已經不能使POD同工酶譜帶保持完整，參試馬鈴薯品種（系）對鹽濃度敏感程度存在差異。

關鍵詞：馬鈴薯試管苗;鹽脅迫;POD酶活性;同工酶

中圖分類號：S513 ? ? ? ?文獻標志碼：A ? ? ? ? 文章編號：1001-1463（2020）06-0012-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2020.06.004

Effects of NaCl Stress on POD Enzyme Activity and Isozyme of Potato Tube Plantlets

PEI Huaidi 1， LIU Runping 2， LIN Yuhong 1， LI Shujie 1， L？譈 Tai 3

（1. Institute of Biotechnology， Gansu Academy of Agriculture Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China;2. Institute of Agricultural Econamic and Information， Gansu Academy of Agriculture Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China;3. Tianshui Institute of Agricultural sciences， Tianshui Gansu 741000， China）

Abstract：In this experiment， the tube plantlets of four potato cultivars（lines） were seleted， Directly induce to differentiate into seedlings on medium containing different NaCl concentrations， preliminary identification of its salt tolerance. The results showed that with the increase of NaCl concentration， the POD enzyme activity of Atlantic， L03-1 and L03-6 showed a decreasing trend compared with treatment without stress， but the POD enzyme activity of L03-2 showed an increasing trend compared with the treatment. Monitoring of POD isoenzymes in NaCl stress potato tube plantlets by polyacrylamide gel electrophoresis showed that the potato salt-induced seedling of POD isozyme bands existed significant differences， salt stress could not maintain the integrity of the POD isozymes. In this experiment four potato varieties on the salt sensitivity presenced difference.

Key words：Potato tube plantlets;Salt induction;POD enzyme activity;Isozyme

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是世界上廣為種植的糧菜兼用型作物，也是我國干旱和半干旱地區重要的經濟作物，屬鹽敏感 型[1 ]，鹽害不利于其生長，且對產量影響極大，因此，培育符合不同育種目標的耐鹽馬鈴薯新品種就顯得十分重要。大量的研究結果表明，馬鈴薯的抗鹽能力較弱[1 - 2 ]，0.2%的鹽逆境就可見脅迫效果，使馬鈴薯出苗遲緩、發芽勢降低、植株矮小甚至死亡，嚴重影響產量和品質。通過常規育種改良品種一直進展緩慢，通過鹽脅迫誘導，進行體細胞無性系變異篩選是進行抗性品種選育的有效途徑之一[3 ]，在許多植物品種改良上已取得成功[4 - 5 ]。我們利用馬鈴薯試管苗再生誘導，對不同品種（系）馬鈴薯進行耐鹽性研究，通過對馬鈴薯莖段外植體的直接鹽脅迫誘導，建立耐鹽愈傷組織變異系誘導和篩選技術，分析鹽脅迫條件下馬鈴薯試管苗POD酶活性變化，探討鹽脅迫誘導產生新的同工酶，以適應鹽脅迫下細胞內的特殊代謝反應，為馬鈴薯耐鹽機理研究提供參考。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 供試材料

供試的馬鈴薯品種（系）為大西洋、L03-1、L03-2、L03-6，均由甘肅省農業科學院生物技術研究所提供。

1.2 ? 試驗方法

根據已有的方法建立馬鈴薯品種（系）的試管苗擴繁體系[6 - 7 ]。試管苗繁殖采用莖切段法，將試管苗剪成1 cm左右帶腋芽的莖段，插入MS固體培養基（pH 5.8）中，每25 d繼代繁殖1次，在3 000 lx 連續光照、溫度（25±1）℃培養備用。將生長25 d左右的試管苗剪成1 cm左右不帶腋芽的莖段，將莖段嵌入固體不定芽誘導培養基A（MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2，4-D）中，pH為5.8，在該培養基中加入不同濃度的NaCl做鹽誘導處理，Na Cl濃度分別為0（CK）、1、2、3、4、5 g/kg。在A培養基中培養7 d左右后，將莖段轉接到分化培養基B（MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA）中，p H為5.8;同樣在該培養基中加入濃度分別為0（CK）、1、2、3、4、5 g/kg的NaCl，每隔7 d用B培養基繼代轉接1次，直到分化成苗。

大西洋、L03-1、L03-2分別在1、2 g/kg NaCl濃度下;L03-6分別在1、2、3 g/kg NaCl濃度下分別得到再生試管苗（預備實驗中，當NaCl濃度大于2 g/kg時，大西洋、L03-1、L03-2愈傷組織褐化嚴重，當NaCl濃度大于3 g/kg時，L03-6愈傷組織褐化嚴重，均沒有得到相應的再生苗），將分化得到的試管苗接種到含相應濃度的MS培養基上生長、繁殖，試管苗生長25 d時進行相關指標的測定。

1.3 ? 測定方法

1.3.1 ? ?過氧化物（POD）酶活性測定 ? ?采用愈創木酚顯色法測定POD酶活性，參照王韶唐的方法[8 ]。

1.3.2 ? ?POD同工酶酶液提取 ? ?取0.2 g葉片置于預冷的研缽中，加入5 mL提取介質[pH 5.9，0.05 mol/L磷酸緩沖液，內含1% PVP（聚乙烯吡咯烷酮）]冰浴研磨成勻漿，于15 000 r/min、4 ℃離心10 min，上清液為酶提取液，4 ℃保存備用。

1.3.3 ? ?POD同工酶電泳分離和染色 ? ?采用聚丙烯酰胺濃度梯度凝膠電泳技術進行POD同工酶電泳分離。聚丙烯酰胺濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為7%，酶液上樣量為15 μL，4 ℃條件下，開始穩壓80 V電泳，0.5 h后加到160 V電泳，電泳時間為6 h。將電泳后的凝膠置于染色液（40 mL聯苯胺儲存液、4% NH4Cl、5% EDTA-Na2、0.3% H2O2、蒸餾水按體積比1∶1∶1∶1∶8配制）中室溫下顯色1～15 min，酶活性區逐漸出現藍色，顯色后漂洗凝膠，最后對凝膠進行掃描。

1.4 ? 數據處理

數據通過Microsoft Excel和SPSS（13.0）軟件進行統計分析。

2 ? 結果分析

2.1 ? NaCl脅迫對馬鈴薯試管苗POD酶活性的影響

從圖1可以看出，NaCl鹽脅迫條件下，除L03-6外馬鈴薯各品種（系）間POD酶活性差異不顯著。隨著NaCl脅迫濃度的增加，大西洋、L03-1的POD酶活性均較對照降低，但差異不顯著;L03-6較對照顯著降低。L03-2隨著NaCl脅迫濃度的增加，POD酶活性呈現先升高后降低的趨勢，與對照差異均不顯著。

2.2 ? NaCl鹽誘導對馬鈴薯試管苗POD同工酶的影響

POD是一種對環境條件十分敏感的氧化酶類，其主要作用是清除氧代謝中產生的H2O2以及能對各種逆境脅迫作出應答[9 - 10 ]。POD譜帶的變化在一定程度上能反映植物抗鹽性的強弱，而且植物受到鹽脅迫時植物組織中的蛋白質也會發生變化[11 ]。從圖2可以看出，馬鈴薯鹽誘導再生試管苗POD同工酶譜帶存在品種（系）間顯著差異。從圖2 a可以看出，鹽誘導已經不能使POD同工酶譜帶保持完整，L03-1、L03-2在鹽誘導下主要是造成大分子量的缺失;小分子量在0.2%濃度下缺失，鹽濃度的增加使酶量的表達減弱。大西洋正好與L03-1、L03-2相反，與對照相比，鹽誘導大分子量酶蛋白第Ⅰ條帶酶量表達的同時，也使小分子量酶蛋白第Ⅲ條和第Ⅳ條帶酶量增加。從圖2 b可以看出，L03-6在大分子量表達上無明顯差異，但是在鹽濃度為3 g/kg時，鹽誘導加強了第Ⅲ條帶酶量的表達，表明酶蛋白合成可能與作物抗氧化酶的影響有關。

3 ? 小結與討論

實驗結果表明，馬鈴薯4個品種（系）的POD酶活性隨著鹽濃度的增加，大西洋、L03-1、L03-6與無脅迫處理相比均呈現降低趨勢，其中大西洋、L03-1與無脅迫處理差異均不顯著，L03-6顯著降低;L03-2在1、2 g/kg時POD酶活性均比無脅迫處理增加，但差異不顯著。從實驗中可以看出，馬鈴薯在遭受到鹽脅迫逆境條件后，具有一定的自我恢復能力，其抗氧化功能較強。鹽誘導馬鈴薯再生苗POD同工酶譜帶品種（系）間存在顯著差異。鹽誘導已經不能使POD同工酶譜帶保持完整，馬鈴薯品系L03-1、L03-2在鹽誘導下主要是造成大分子量的缺失;小分子量在2 g/kg濃度下缺失，鹽濃度的增加使酶量的表達減弱。大西洋正好與L03-1、L03-2相反，與無脅迫處理相比，鹽誘導使大分子量酶蛋白表達的同時，也使小分子量酶蛋白的表達量增加。L03-6在大分子量表達上無明顯差異，但是在鹽濃度為3 g/kg時，鹽誘導加強了第Ⅲ條帶酶量的表達，表明酶蛋白合成可能與作物抗氧化酶的影響有關。

過氧化物酶（POD）屬于植物體內的一類保護酶，它對逆境的反應非常敏感，可以清除過氧化物，在植物的抗性中起著重要的作用?；驔Q定酶，酶催化調節細胞代謝。細胞受到鹽脅迫會發生一系列特殊的代謝變化，甚至造成代謝紊亂。在遺傳上集中表現為基因表達的改變[12 - 13 ]。通過細胞內代謝產物的誘導或阻遏作用以及信號傳導等機制調節基因的表達，迅速提高或降低原有酶的活性，或誘導產生新的同工酶，以適應鹽脅迫下細胞內的特殊代謝反應，使其得以生存。

參考文獻：

[1] 龔家棟. ?馬鈴薯不同品種耐鹽性差異初步研究[J]. ?中國沙漠，1996，16（1）：61-66.

[2] 裴懷弟，張敏敏，劉新星，等. ?NaCl脅迫條件下馬鈴薯再生苗耐鹽性研究[J]. ?甘肅農業科技，2014（11）：39-41.

[3] 徐乃瑜. ?培養抗性植物的細胞與組織培養途徑[J]. ?武漢植物研究，1987，5（3）：34-36.

[4] 韋小敏，季良越，胡彥民，等. ?玉米耐鹽愈傷組織變異體的篩選初報[J]. ?河南農業大學學報，2000，34（4）：324-328.

[5] 王長泉，宋 ? 恒. ?杜鵑抗鹽突變體的篩選[J]. ?核農學報，2003，17（3）：179-183.

[6] 裴榮信. ?馬鈴薯莖尖脫毒種薯技術的改進[J]. ?馬鈴薯雜志，1998（2）：223-227.

[7] 厚毅清，張艷萍. ?紫色馬鈴薯隴薯03-01試管數誘導體系的優化研究[J]. ?甘肅農業科技，2010（7）：10-11.

[8] 王韶唐. ?植物生理學實驗指導[M]. ?西安：陜西科學技術出版社，1987.

[9] BARCELOA R. The generation of H2O2 In the xylem of zinnia elegans ismediated by an NADPH- oxidase- like enzyme[J]. ?Planta，1998，207：207-216.

[10] BELIGNIM V，LAMATTINA L. Nitric oxide counteracts cytotoxic processes mediated by reactive oxygen species in plant tissues[J]. ?Planta，1999，208：337-344.

[11] RAMON S，ROBERTOG，GABINORIOS. Salt stress proteins identified by a functional approach in yeast[Z]. ?Monatshefte Fur-Chemie，2003.

[12] SINGH N K，NELSON D E，KUHN D PM，et al. Molecular coning of osmotin and regulation of expression by ABA and adaption to low water potentials[J]. ?Plant Physiol.，1989，90：1096-1101.

[13] GALWEZA F，GULICK P J，DVORAK J. Characterization of the earley stages of genetic salt stress responses in salt tolerant Lophopyrum elongatum，salt sensitive weat，and their amphiploid[J]. ?Plant Physiol.，1993，103：257-265.

（本文責編：陳 ? ?偉）