美拉德交聯對乳清分離蛋白-酪蛋白酸鈉-普魯蘭多糖薄膜阻隔性及抗氧化性的改性研究

郄梓含，雷橋，2，3*，高文婧，曹慶龍

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)2(上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海，201306) 3(農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海)，上海，201306)

近年來，可降解和可食性食品包裝材料備受關注。其中，多糖和蛋白質等可食用薄膜的優勢已有了一定的研究[1-2]。乳清分離蛋白(whey protein isolate，WPI)是一種高質量的動物全價蛋白，易于消化和吸收，具有很高的營養價值，含有多種必需氨基酸和生物活性成分。此外，乳清分離蛋白薄膜具有良好的機械性能和氧氣阻隔性能[3]。酪蛋白酸鈉(sodium caseinate，NaCas)是一種可溶性的磷酸鈣化合物，其中含有人體所需的多種氨基酸和微量元素，具有良好的成膜性和水溶性[4]。普魯蘭多糖(pullulan)是一種水溶性微生物多糖，由金黃色芽孢桿菌發酵產生[5]；由普魯蘭多糖制成的薄膜無色透明，具有良好的阻氣性[6]、阻油性和熱封性，其涂層材料可用于水果和蔬菜的保鮮[7]，與其他有機聚合物材料相比，無毒且易于降解[8]。但是，單純的普魯蘭多糖薄膜易碎，為此，通常會添加混合其他物質改良使用[9]。

美拉德反應是一種非酶褐變，廣泛應用于食品工業。它是羰基化合物和氨基化合物之間的反應，經過復雜的過程后，會產生許多美拉德反應產物。美拉德反應產物的功能性一直是研究的熱點。如，QIAN等[10]已經研究了美拉德反應產物的DPPH自由基清除活性，以及OH等[11]研究了還原力和Fe2+螯合活性的方法。這些研究均發現蛋白質與糖類發生美拉德反應后抗氧化活性有所增加。KCHAOU等[12]還發現美拉德反應產物能夠改善魚明膠基薄膜的物理化學、感官和生物學特性。

本課題前期研究中，陳桂云等[13]研究了乳清分離蛋白、酪蛋白酸鈉和海藻酸鈉復合薄膜的包裝性能；尋倩男等[14]研究了酪蛋白酸鈉和明膠復合薄膜的包裝性能。與純蛋白薄膜相比，海藻酸鈉與明膠等多糖的添加，提高了薄膜的柔韌性、透光率等，但因為多糖本身的屬性，也增大了薄膜的水溶性，降低了水蒸氣及氧氣阻隔性，限制了薄膜在食品包裝中的廣泛應用。

為此，本研究擬通過構建蛋白質-多糖美拉德反應的改性方法，以期提高復合薄膜的疏水性、阻隔性并開發其抗氧化性等功能特性，從而進一步拓展可食性薄膜的應用領域。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清分離蛋白(蛋白質含量>98%)，Isopure公司(美國)；酪蛋白酸鈉(蛋白質含量>99.21%)，上海麥克林生化科技有限公司(中國)；普魯蘭多糖(多糖含量>98%)，薩恩化學技術(上海)有限公司；甘油，上?？犰`精細化工有限公司。

OX-TRAN 2/21氧氣透過率測試儀，美國膜康公司；Nicolet iS10傅立葉紅外光譜儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；S3400N型掃描電鏡，日本日立公司；U-3900分光光度計，日本日立公司；CR-400色差儀，日本柯尼卡美能達公司；W-B-31D水蒸氣透過率測試儀，廣州西唐機電科技有限公司；XLW(EC)型智能電子拉力試驗機，濟南藍光機電技術有限公司；DF-101S磁力攪拌器，河南雨花儀器公司；DHG-9045A型恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；恒溫恒濕箱，上海一恒科技有限公司；WGT-S透光率/霧度測試儀，上海精科有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 薄膜的制備

將乳清分離蛋白，酪蛋白酸鈉和普魯蘭多糖分別溶解在去離子水中；用磁力攪拌器在室溫下連續攪拌2 h，直到完全溶解。將乳清分離蛋白溶液和酪蛋白酸鈉溶液置于85 ℃的水浴中攪拌30 min后以體積比1∶1混合，將混合后的蛋白溶液再與普魯蘭多糖溶液分別以體積比1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1混合。在成膜溶液中加入35%(占成膜溶液干物質的質量分數)甘油，并在室溫下攪拌60 min。將復合溶液真空脫氣，并將等量的溶液倒入平皿中，65 ℃的條件下，在恒溫鼓風干燥箱中干燥6～8 h，干燥后，從平皿上揭下薄膜。隨后，將薄膜置于95 ℃的恒溫鼓風干燥箱中加熱24 h，以發生美拉德反應。將薄膜在23 ℃、50% RH的條件下置于恒溫恒濕箱內平衡48 h以上，然后進行薄膜的各項性能測試。將1∶1的未經過加熱處理的薄膜作為對照組進行研究。

1.2.2 薄膜厚度的測定

在每個薄膜樣品上選取5個點，采用螺旋測微器進行測量，取其平均值作為薄膜的厚度值。在計算力學性能、透氣性能、透濕性能等性能時，采用該參數值。

1.2.3色度測量

根據KCHAOU等[12]的方法，使用色差儀測量薄膜的色度。獲得薄膜的L(亮度)，a(紅/綠)和b(黃/藍)值。每個樣品測3次，取平均值計算。采用公式(1)計算色差(ΔE)：

(1)

式中：L，亮度；a，紅綠值；b，黃藍值；L′、a′、b′為標準白板的色度值(L′=94.16，a′=-0.48，b′=4.59)。

采用公式(2)計算薄膜的褐變指數(browning index，BI)：

(2)

式中:L,亮度；a,紅綠值；b,黃藍值。

1.2.4 光學性能測量

用透光率測試儀測量薄膜的透光率及霧度。根據夾樣器的尺寸將薄膜切好后放置在測試架上，使得光線垂直透過薄膜。每個樣品測3次，取平均值。

1.2.5 交聯度的測定

交聯度根據KCHAOU等[12]的方法進行測量。其原理是使游離氨基與2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)反應。具體方法為：在40 ℃的條件下，將約10 mg的薄膜浸入復合溶液中2 h，該復合溶液由1 mL的0.01% TNBS溶液和1 mL 4% NaHCO3溶液組成。然后，將2 mL 6 mol/L的HCl添加到該溶液中。溶液在60 ℃的條件下進一步反應90 min以充分水解。最后，用分光光度計在415 nm處測量溶液的吸光度。交聯度由公式(3)計算：

(3)

式中：A，交聯薄膜的吸光度；A′，未交聯薄膜的吸光度。

1.2.6 薄膜微觀結構

使用掃描電子顯微鏡觀察薄膜的橫截面的微觀結構。薄膜樣品浸入液氮中冷凍破碎，然后斷裂面朝上，垂直固定在樣品盤，并進行噴金處理10 min。使用6 kV的加速電壓觀察所有樣品。

1.2.7 蛋白質結構變化

采用傅立葉紅外光譜儀進行FTIR分析。在測試期間，環境濕度保持在35%RH以下。將薄膜樣品制成合適的圓形，然后置于樣品架上進行掃描。在400～4 000 cm-1掃描，掃描頻率為4 cm-1。

1.2.8 機械性能測量

采用電子拉力試驗機測定膜樣品的抗拉強度和斷裂伸長率。將樣品切成15 mm×120 mm的長條，初始距離設置為50 mm，速度為300 mm/min。每種樣品薄膜測量6次。通過公式(4)計算抗拉強度：

(4)

式中:TS,抗拉強度，MPa；F,薄膜斷裂時的最大拉力，N；S，薄膜的橫截面積，mm2。

1.2.9 氧氣透過率測定

采用氧氣透過率測試儀進行測試。用樣品切割器將薄膜切成合適的大小，將氣源的壓力調節至0.5 MPa，薄膜兩側壓力為0.1 MPa，在恒定溫度23 ℃下測定薄膜的透氧率。所選的薄膜不應有破損或氣泡。

1.2.10 水蒸氣透過率測定

薄膜的水蒸氣透過率(water vapor permeability，WVP)采用水蒸氣透過率測試儀進行測試。用樣品切割器將薄膜切成合適的尺寸，樣品杯中放適量的氧化鈣，將樣品固定在樣品杯中后放置于測試腔中，采用增重法，相對濕度為90% RH，試驗溫度為38 ℃。

水蒸氣滲透率的計算如公式(5)所示：

(6)

式中：G，質量變化，g；t，時間，h；A，測試面積，m2；T，測試樣品的厚度，mm；ΔP，薄膜兩側的水蒸氣的分壓差。

1.2.11 抗氧化活性的測定

在評估美拉德反應產物的抗氧化活性時，由于這些化合物的復雜性，必須使用多種測定方法[15]。因此，基于WPI-NaCas-Pullulan膜的DPPH自由基清除活性，還原能力和總抗氧化劑活性來確定其抗氧化活性。

1.2.11.1 清除自由基活性(free redical-scavenging activity，FRSA)

如KCHAOU等[12]的方法，在此基礎上進行了部分改進，對薄膜的DPPH自由基清除活性進行了測定。將薄膜分別切成小塊(m=20 mg)，放入離心管中，再分別加入1 000 μL的蒸餾水、750 μL的99.5%(體積分數)乙醇和250 μL的0.02 mmol/L DPPH的99%(體積分數)乙醇溶液。將混合物在室溫下避光放置24 h后，采用分光光度計在517 nm處測量。除薄膜樣品外，對照組以相同方式進行。FRSA計算如公式(6)所示：

(6)

式中：AC， DPPH溶液的吸光度；AS，包含薄膜樣品的DPPH溶液的吸光度；Ab，不添加DPPH溶液的包含膜樣品的空白管的吸光度。

1.2.11.2 還原能力

用MATMAROH等[16]的方法，在此基礎上進行了部分改進，對薄膜的還原能力進行測定。稱約10 μg樣品放于離心管中，分別加入0.5 mL蒸餾水、1.25 mL的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液和1.25 mL的10 g/100mL鐵氰化鉀，50 ℃水浴3 h。然后，取1 mL反應溶液，加入500 μL的10 g/100mL三氯乙酸。將混合溶液以3 000 r/min離心10 min，將1.25 mL上清液與1.25 mL蒸餾水和0.25 mL 0.1 g/100mL氯化鐵混合。反應10 min后，采用分光光度計在700 nm處測量所得溶液的吸光度值。反應混合物的吸光度越高，還原能力越強。

1.2.11.3 總抗氧化活性

根據PRIETO等[17]的方法測定薄膜的總抗氧化活性。該方法是使用樣品在酸性條件下將Mo(Ⅵ)還原為Mo(Ⅴ)并形成綠色磷酸鹽/ Mo(Ⅴ)絡合物。將薄膜樣品切成30 mg的小塊放入離心管中，加入0.3 mL蒸餾水和3 mL試劑溶液(0.6 mol/L硫酸，28 mmol/L磷酸鈉和4 mmol/L鉬酸銨)。然后，將離心管密封并在90 ℃水浴下放置90 min。之后，將樣品冷卻至室溫，并在695 nm下測量其吸光度。按公式(7)將薄膜的總抗氧化活性表示為α-生育酚當量：

A=0.011Ctoc+0.004 9R2=0.987

(7)

式中：A，薄膜在695 nm處的吸光度；Ctoc，以α-生育酚當量計的濃度，μmol/mL。

1.2.12 統計分析

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計處理和分析。數據表示為平均值±標準差，并通過SNK方法進行顯著性分析(P<0.05)[18]。Origin 9.0用于圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 色度和光學特性的變化

經過美拉德反應后的薄膜的顏色從淡黃色變為棕色。棕色的產生與蛋白質和多糖美拉德反應作用有關。整體來看，與對照組薄膜樣品相比，經過處理的各組薄膜的L值均有下降；a、b值均有提高。ΔE提高了9.58～13.31倍(表1)。

表1 WPI-NaCas-pullulan薄膜的色度和光學特性

除了色度值外，褐變指數BI值也能表征美拉德反應的程度[19]。與對照組薄膜相比，各組經過處理后的薄膜的BI值提高了8.27～15.15倍。通過顏色變化，可以得知復合蛋白質與普魯蘭多糖比例為1∶3(體積比)時，美拉德反應最為劇烈。

純的普魯蘭多糖膜無色透明，與乳清分離蛋白和酪蛋白酸鈉混合成膜后透光率降低，霧度均提高；經過美拉德反應后，薄膜顏色變為棕色，各組薄膜的透光率進一步降低8.76%～29.99%，產生了避光作用，可應用于需避光保存及易氧化的物品包裝。

2.2 交聯度變化

圖1顯示了WPI -NaCas-pullulan薄膜的交聯度，該方法基于非交聯薄膜和交聯薄膜中游離氨基的測定。在美拉德反應的早期，含游離氨基的蛋白質，如賴氨酸的ε-NH2基團，會與普魯蘭多糖的羰基反應，導致游離氨基的損失[20]。這種交聯的定量化學方法證實了而后討論的定性FTIR數據，表明了在熱處理后通過還原糖使糖基化。對于1∶3組經處理后的薄膜，交聯度達到最大約84.033%。從該結果來看，比例為1∶3、3∶1的膜的交聯度高于其他組。這可能是因為多糖與蛋白質分別在反應中過量，可以完全反應。并且過量的多糖可作為增塑劑，這對交聯度、機械性能和阻隔性能都有影響。

圖1 不同比例的WPI -NaCas-pullulan薄膜的交聯度Fig.1 Degree of crosslinking of WPI-NaCas-pullulan-based films of different ratios注：不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.3 薄膜的微觀結構

圖2是WPI-NaCas-pullulan薄膜橫截面的電鏡圖。由圖2可以看出，圖2-a顯示的對照組薄膜截面粗糙、有較多褶皺和孔洞；圖2-b和圖2-c顯示的實驗組薄膜截面褶皺較少，光滑且致密，孔洞較少。由此可知，經過美拉德反應處理的薄膜截面光滑、致密且孔洞較少。由B、D組間對照，可看出，普魯蘭多糖添加量越多，截面越光滑致密，這與交聯度和阻氧性變化的結果相一致。

a-A組薄膜(對照組);b-B組薄膜;c-D組薄膜圖2 不同比例的WPI -NaCas-pullulan薄膜的電鏡圖Fig.2 The SEM photograph of WPI-NaCas-pullulan-based films of different ratios

2.4 蛋白質結構變化

圖3 不同比例的WPI-NaCas-pullulan薄膜的FTIR光譜Fig.3 FTIR spectra of WPI-NaCas-pullulan films of different ratios

2.5 機械性能

由于美拉德反應的作用，各組薄膜的抗拉強度值顯著提高(圖4)。與未處理薄膜相比，F組薄膜的抗拉強度與對照組相比，提高了約2.42倍；在各組薄膜中，WPI-NaCas主要賦予材料強度硬度，pullulan則賦予材料塑性。實驗發現，各組樣品中，抗拉強度最大的為F組，這是因為該組的交聯度較高，且WPI-NaCas含量較高，pullulan含量低，薄膜的硬度和脆度增大。然而，隨著薄膜強度、硬度的提高，其彈塑性下降，因而，美拉德反應導致了薄膜斷裂伸長率不同程度的下降。

圖4 不同比例的WPI-NaCas-pullulan薄膜的機械性能Fig.4 Mechanical properties of WPI-NaCas-pullulan films of different ratios

2.6 阻氧性能的變化

由圖5可以看出，熱處理24 h后，由于美拉德反應的交聯作用，薄膜的氧氣透過率均顯著低于對照組薄膜，氧氣透過率降低了54.46%～94.19%。其中，B組體現出最優的阻氧性能，這可能是因為足量的多糖充當了交聯劑和增塑劑，并通過分子間和分子內折疊產生了異常緊密的結構。

圖5 不同比例的WPI-NaCas-pullulan薄膜的氧氣透過率Fig.5 Oxygen transmission rate of WPI-NaCas-pullulan films of different ratios

2.7 水蒸氣透過率

復合蛋白膜親水性導致的高水蒸氣透過率一直是限制其應用的因素之一[21]。通過美拉德反應改性，薄膜的水蒸氣透過率顯著降低了61.07%～94.40%(圖6)。美拉德反應使蛋白質分子和多糖分子緊密交聯，顯著提高了薄膜的疏水性，使得復合蛋白膜的應用前景更為廣闊。

圖6 不同比例的WPI-NaCas-pullulan薄膜的水蒸氣透過率Fig.6 Water vapor permeability of WPI-NaCas-pullulan films of different ratios

2.8 美拉德反應活化膜的抗氧化性能

WPI-NaCas-pullulan基薄膜的DPPH自由基清除活性如圖7所示。與對照組相比，所有實驗組均表現出顯著增強的清除自由基活性。薄膜清除DPPH自由基的能力是由于其氫原子轉移能力，在經過美拉德反應之后明顯增加。B組表現出較高的DPPH自由基清除能力，達到85.613%。實驗結果表明，美拉德反應產物具有貢獻氫原子的能力，從而穩定了自由基。

圖7 不同比例的WPI-NaCas-pullulan薄膜的DPPH自由基清除能力Fig.7 DPPH radical scavenging ability of WPI-NaCas-pullulan films of different ratios

WPI-NaCas-pullulan復合膜將三價鐵離子轉化為亞鐵離子的能力如圖8所示，結果表明，對照組在700 nm處的吸光度最初分別為1.275，還原能力在美拉德反應后，各組吸光度分別提高到6.853、3.867、3.685、3.715和4.265。圖9顯示美拉德反應活化處理后的薄膜顯示出較高的抗氧化活性，分別達到約489.706、283.524、256.788、261.797和467.433 μmol/mL當量的α-生育酚，抗氧化活性分別為對照組的2.75～5.23倍。

圖8 不同比例的WPI-NaCas-pullulan薄膜的還原力Fig.8 Reducing power of WPI-NaCas-pullulan films of different ratios

圖9 不同比例的WPI-NaCas-pullulan薄膜的總抗氧化活性Fig.9 Total antioxidant activity of WPI-NaCas-pullulan films of different ratios

實驗發現，對照組薄膜樣品也存在一定的抗氧化性，這可能是因為在初級薄膜烘干過程中，在較低的溫度條件下，已經有微弱的美拉德反應產生。

3 結論

采用熱處理誘導美拉德反應活化改性的方法，大大改善了WPI-NaCas-pullulan薄膜的性能，顯著提高了薄膜的疏水性、交聯度及阻隔性，并賦予了薄膜優良的抗氧化活性。各樣品中，當WPI-NaCas/pullulan體積比為1∶3時，薄膜的美拉德反應最為劇烈，改性效果最為顯著：交聯度達84.033%，氧氣透過率為0.043 cm3/(m2·d)，水蒸氣透過率為8.4×10-13g·cm/(cm2·s·Pa)，DPPH自由基清除率為85.613 %，還原力OD700nm為6.853，總抗氧化活性表現出489.706 μmol/mL當量的α-生育酚。

基于美拉德改性后的WPI-NaCas-pullulan薄膜具有良好的阻氧性及抗氧化性，可應用于包裝油脂、肉類以及部分干物料。若將其應用在方便食品調味包內包裝中，則既可防止油脂氧化，又由于薄膜有水溶性，極大減少了包裝廢棄物。為了更好地延長食品的貨架期，將其與氣調包裝相結合，未來將在食品保藏領域發揮更廣闊的作用。