改性蛭石吸附-包埋法固定化脂肪酶的研究

黃靜，梁密

1(遼寧工程技術大學 理學院，遼寧 阜新，123000)2(遼寧工程技術大學 材料學院，遼寧 阜新，123000)

脂肪酶又名三?；视退饷?EC 3.1.1.3)，在植物、動物以及微生物中較普遍存在[1-2]。其廣泛應用于造紙工業、有機合成工業、污劑工業、食品工業及生物表面活性劑工業中，尤其脂肪酶在進行生物柴油的合成工業中一直備受關注，是目前研究的熱點催化劑之一[3-6]。而脂肪酶成本高且易失活是制約其應用的主要障礙[7]，脂肪酶根據其應用形式可分為游離酶與固定化酶。固定化酶是指通過物理或者化學的方法將酶結合在固定相載體上，使本來分散于流動液相與底物均相混合的游離酶成為與底物異相接觸的固定相，從而使酶的催化反應被限制在固定相上進行[8]。游離酶在應用中存在穩定性較差、產物分離純化困難、不能反復利用等缺點[9-10]；而固定化酶對熱的穩定性提高、對蛋白酶的抵抗性增強、具有較強的耐酸耐堿性、有較高抵制變性劑及抑制劑的性能、能夠實現酶與產物的分離、可反復使用、降低成本，便于自動化生產[11-13]。在脂肪酶的固定化方面，眾多學者對固定化載體及固定化方法開展了深入的研究[14-16]。楊本宏等[17]研究了海藻酸鈉作為載體，采用包埋的方法固定化德氏根霉脂肪酶的最佳條件。王愛玲等[18]以海藻酸鈉與明膠復合物為載體，用包埋法固定化黑曲霉脂肪酶，研究了海藻酸鈉、明膠濃度諸因素對固定化的影響，對固定化酶和游離酶的穩定性進行了研究。

蛭石具有天然、豐富的孔徑結構、比表面積較大、吸附性較好，機械剛性和熱穩定性很好，能夠有效防止微生物的降解作用，環保且價格低廉，符合作為固定化酶載體的基本條件[19-20]；若對蛭石進行適當的改性，還能提高其吸附能力等[21]。目前廣泛應用的酶的固定化方法有交聯法、共價法、包埋法和吸附法。共價法和交聯法的反應條件通常很劇烈，對酶造成的影響較大；包埋法和吸附法的反應條件較溫和，對酶造成的影響較小。但是由于吸附法固定化脂肪酶的載體與酶的作用力很弱，容易脫落，其穩定性較差，而包埋法是將酶限制在一定空間內，可以提高其穩定性。因此課題擬以改性蛭石為載體，采用吸附-包埋結合法對脂肪酶進行固定化，探究脂肪酶的固定化機理及固定化脂肪酶的性能，為脂肪酶固定化載體、方法、機理的研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑曲霉脂肪酶(20 000 U/g)、4-硝基苯磷酸二鈉鹽(disodium 4-nitrophenyl phosphate,p-NPP),Sigma公司;蛭石,石家莊雨馨建筑材料有限公司;HCl、NaH2PO4、Na2HPO4明膠、海藻酸鈉、CaCl2均為分析純。

1.2 儀器與設備

HH-8恒溫水浴鍋，上?？莆鲈囼瀮x器廠；GZX-9140MBE數顯鼓風干燥箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；JSM-7800F掃描電子顯微鏡，日本島津制作所；THZ-82氣浴恒溫振蕩器，常州朗越儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蛭石的改性

1.3.1.1 蛭石的酸改性

分別將5 g 325目蛭石和1 000目蛭石與100 mL質量分數為8%的HCl混合，80 ℃水浴下攪拌2 h，水洗至中性，60 ℃下烘干，備用。

1.3.1.2 改性蛭石的表征

分別取少量325目和1 000目改性前后蛭石噴金處理后，在JSM-7 800F掃描電子顯微鏡下觀察其表面形貌。

1.3.2 改性蛭石固定化脂肪酶條件的優化

1.3.2.1 吸附法固定化脂肪酶條件的優化

取1 g脂肪酶溶于30 mL H3PO4緩沖液中。將一定量干燥載體加入到脂肪酶緩沖溶液中，一定溫度下振蕩固定化一定時間后，過濾，用磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.0)洗滌至上清液中檢測不到脂肪酶。在單因素預試驗基礎上選擇載體含量、固定化溫度及固定化時間3個因素，每個因素3個水平，采用L9(34)正交表進行正交試驗。固定化酶按照游離酶的方法進行酶活力測定，并根據公式(1)計算酶活力回收率：

(1)

1.3.2.2 吸附-包埋法固定化脂肪酶條件的優化

在上述吸附好的酶反應體系中加入15 mL一定質量濃度的海藻酸鈉和15 mL一定質量濃度的明膠，使其充分混合均勻，立刻將其用注射器注射到一定濃度的CaCl2中，形成最終的固定化酶。在單因素預試驗基礎上選擇海藻酸鈉質量濃度、明膠質量濃度及CaCl2濃度3個因素，每個因素3個水平，采用L9(34)正交表進行正交試驗。固定化酶按照游離酶的方法進行酶活力測定，并根據公式(1)計算酶活力回收率。

1.3.3 脂肪酶活力測定

配制0～70 μmol/L濃度梯度的4-硝基苯酚溶液，測定OD405，繪制標準曲線。取4支試管(空白管及3支平行樣品管)，將150 μL適當稀釋的酶液(游離酶或固定化酶)加入到2.70 mL Tris-HCl緩沖液中(50 mmol/L，pH 7.5)，其中空白管需要在沸水中煮5 min滅活酶，然后將4支試管置于恒溫振蕩器上(45 ℃，180 r/min)預熱5 min，再加入150 μL底物乳液(5 mmol/L p-NPP)，混勻后在恒溫振蕩器上反應5 min(45 ℃，180 r/min)，隨即迅速置于沸水中煮5 min終止反應，冷水浴降溫后測OD405[22]。

酶活力單位(U)定義：在以上條件下，1 min催化底物水解產生1 μmol 4-硝基苯酚所需的酶量為1個酶活力單位。

1.3.4 固定化脂肪酶的表征

分別取少量最優固定化條件下的吸附法固定化脂肪酶和吸附-包埋法固定化脂肪酶進行噴金處理后，在JSM-7 800F掃描電子顯微鏡下觀察其表面形貌。

1.3.5 脂肪酶催化性能的研究

1.3.5.1 游離酶與固定化酶的熱穩定性的研究

將一定量的游離脂肪酶和固定化脂肪酶分別放在30、40、50、60、70 ℃的環境下4 h，取出測量其酶活力。

1.3.5.2 游離酶與固定化酶的儲存穩定性的研究

取一定量的游離脂肪酶和固定化脂肪酶放在4 ℃的冰箱里，每隔7 d取出測量1次酶活力。以殘留酶活為測定指標，根據公式(2)計算殘留酶活：

(2)

1.3.5.3 游離酶與固定化酶的重復使用穩定性的研究

固定化酶與游離酶反應完成后，用pH=7的H3PO4緩沖液將其清洗至反應物無殘留，進行1、2、3、4、5次循環，每次分別對脂肪酶的活力進行測定，以殘留酶活為測定指標，根據公式(2)計算殘留酶活。

1.3.6 固定化脂肪酶動力學參數的測定

選取最佳固定化條件下的吸附-包埋法固定化脂肪酶，確定其濃度，將底物配置成不同濃度[S]的溶液，在40 ℃下反應，測定反應的初始速度[V]，用Origin 8.0軟件進行非線性擬合，得到該固定化脂肪酶對底物的最大反應速率Vmax和Km值等動力學參數。

2 結果與分析

2.1 載體的表征

圖1為325目和1 000目改性前后蛭石在2 000倍電鏡下的表面形態。由2 000倍電鏡圖可知，1 000目改性后蛭石出現了較多溝壑狀孔隙，比表面積較大，顆粒質感疏松，較大的比表面積提供了與酶分子充分大的接觸面，使其更有利于吸附固定化脂肪酶。

a-325目改性前蛭石;b-325目改性后蛭石;c-1 000目改性前蛭石;d-1 000目改性后蛭石圖1 325目蛭石和1 000目蛭石改性前后的電鏡圖(×2 000)Fig.1 The SEM photograph of before and after modification of 325 mesh vermiculite and 1 000 mesh vermiculite

2.2 固定化脂肪酶的條件優化

2.2.1 吸附法固定化脂肪酶的條件優化

表1為正交試驗結果，由表1可知，各因素對固定化酶回收率影響大小的先后次序為B>C>A，即固定化時間>固定化溫度>載體含量；最佳提取條件為A1B2C2，即載體含量含量為1 g，固定化時間3 h，固定化溫度為25 ℃，在此條件下回收率可達到83.47%。這說明，此最佳固定化工藝并沒有明顯降低酶的活性，酶的活性部位不受固定化載體的干擾。

表1 正交試驗結果Table 1 The results of orthogonal test

2.2.2 吸附-包埋法固定化脂肪酶的條件優化

表2為正交試驗結果，由表2可知，各因素對固定化酶回收率影響大小的先后次序為B>C>A，即海藻酸鈉質量濃度>CaCl2濃度>明膠質量濃度；最佳提取條件為A1B2C2，即明膠的質量濃度為5 g/L，海藻酸鈉的質量濃度為20 g/L，CaCl2濃度0.04 mol/L，在此條件下回收率可達到82.77%。

表2 正交試驗結果Table 2 The results of orthogonal test

2.3 固定化脂肪酶的表征

圖2為吸附法固定化脂肪酶和吸附-包埋法固定化脂肪酶在2 000倍電鏡下的表面形態。由2 000倍電鏡圖可知，脂肪酶吸附在改性蛭石上，吸附包埋法后形成了凝膠包埋的小球。

a-吸附法固定化脂肪酶;b-吸附-包埋法固定化脂肪酶圖2 固定化脂肪酶的電鏡圖(×2 000)Fig.2 The SEM photograph of Immobilized lipase

2.4 脂肪酶的催化性能

2.4.1 游離酶與固定化酶的熱穩定性

熱穩定性是衡量酶催化性能的一個重要指標，它能使酶在高溫下發揮生物催化劑的作用，這可能是某些反應過程所必需的[21]。由圖3可知，隨著反應溫度升高，游離與固定化脂肪酶的相對酶活力均呈現先升高后降低的趨勢，當溫度達到40 ℃時相對酶活力最大；且固定化脂肪酶的相對酶活力較游離脂肪酶高，這說明固定化脂肪酶熱穩定性較好。

圖3 溫度對脂肪酶活力的影響Fig.3 Effect of temperature on the lipase activity

2.4.2 游離酶與固定化酶的存儲穩定性

酶的固定化是提高其存儲穩定性的主要手段，固定化條件決定了酶的穩定性，因為它取決于酶與載體基質之間的相互作用[21]。由圖4可知，存儲7 d后吸附-包埋法固定化脂肪酶的殘留酶活為98.38%，存儲21 d后為91.05%，存儲42 d后為66.71%，存儲56 d后為59.59%，這說明固定化脂肪酶具有較高的存儲穩定性，這可能是由于固定化使脂肪酶的機械剛性增強，提高了其穩定性。

圖4 固定化脂肪酶的儲存穩定性Fig.4 The store stability on the immobilized lipase activity

2.4.3 游離酶與固定化酶的重復使用穩定性

酶的重復利用在生物催化過程中起著重要作用。由圖5可知，吸附-包埋固定化脂肪酶重復使用7次后，殘留酶活為85.33%。

圖5 固定化脂肪酶的重復使用穩定性Fig.5 The reustability on the immobilized lipase activity

這與MARTA等[23]研究的殼聚糖-膠原包覆磁性脂肪酶重復使用5次后仍保留80%～90%的酶活力，重復使用7次后可保留80%左右的酶活力的結果比較接近，且較吸附法固定化脂肪酶的重復利用穩定性有較大的提高。這說明此固定化工藝效果較好，酶和載體之間形成了相對較強的相互作用，經過多次使用和洗滌后，其活性構象仍能保持良好的狀態，具有良好的可重復利用性。

2.5 固定化脂肪酶動力學參數

Km值的大小通常與酶的性質有關，通過Km值的大小可以得出酶與底物親和力的強弱。將底物的不同濃度[S]及測得的反應的初始速度[V]代入米氏方程，如公式(3)、公式(4)所示：

(3)

由米氏方程變形得：

(4)

3 結論

研究結果表明,1 000目蛭石改性后比表面積較大、孔徑結構較豐富。脂肪酶的最佳固定化工藝為脂肪酶與載體質量比為1∶1，溫度為25 ℃，吸附時間為3 h，海藻酸鈉的質量濃度為20 g/L，明膠的質量濃度為5 g/L，CaCl2溶液濃度為0.04 mol/L，在此條件下脂肪酶活力回收率可達到82.77%；游離與固定化脂肪酶的最適催化溫度均為40 ℃，且固定化酶的熱穩定性較好；固定化脂肪酶存儲56 d后仍能保留59.59%的酶活力，說明其存儲穩定性較好；固定化脂肪酶經過7次重復回收利用后，酶活力仍可保留原來的85.33%，說明其重復使用穩定性較好。