發酵米粉中優良細菌的分離篩選及鑒定

熊香元，張立釗，陳力力*，龔慧可，周玥，任佑華

1(湖南農業大學 食品科技學院, 湖南 長沙, 410128)2(食品科學與生物技術湖南省重點實驗室(湖南農業大學)，湖南 長沙, 410128)

發酵米粉是我國南方一種傳統食品，目前發酵米粉多采用自然發酵方式生產，即利用原料和 “續渣液”中的微生物在自然條件下完成大米浸泡發酵，再經過磨漿、蒸煮、擠壓成型等工序制成米粉[1]。大米在浸泡發酵過程中，由于微生物代謝產生的有機酸和酶等代謝產物作用使大米化學成分以及保水力、糊化特性、熱特性、老化特性等大米(粉)淀粉特性發生改變，從而改善了成品米粉的蒸煮品質、質構特性、食味品質等食用品質[2]。

自然發酵過程中微生物組成復雜，其種群易受環境影響，發酵時間隨季節變化差異較大，使產品工藝參數、生產過程難以實現規范化和標準化，造成產品質量不穩定[3]。有學者分離鑒定米粉發酵過程中的優勢微生物是乳酸菌和酵母菌[4-5]，近年來有許多研究認為秈米中淀粉結構、蛋白質和脂肪含量影響米粉的峰值黏度、凝膠強度和口感等[6-9]，發酵過程中微生物產生的淀粉酶改變大米淀粉中直/支比例，提高米粉糊化和凝膠特性[10]；蛋白酶不僅為微生物提供自身生長所需的氮源，還減少大米蛋白質，使米粉食味品質更好[11];脂肪酶將脂肪分解為游離脂肪酸，增加米粉香氣，提升米粉感官品質[12]。微生物胞外酶是微生物代謝過程中的次級代謝產物，其活性強弱是判斷菌株是否具有制備成發酵劑的關鍵[13]。然而，目前以產酸、產酶活力為考核指標進行發酵米粉中優良菌株篩選的報道較少。因此，本試驗以大米發酵液中菌株的產酸和產酶活力為綜合考核指標，進行菌株分離篩選,獲得適合米粉發酵的優良菌株，為實現發酵環節的合理控制,推進發酵米粉從傳統自然發酵向標準化轉型，提高產品質量并保證品質穩定,制備純種發酵菌劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料為湖南常德鮮濕米粉加工廠發酵3 d大米浸泡發酵液；MRS瓊脂培養基、MRS肉湯，廣東環凱微生物科技有限公司；珍桂矮1號秈米，陽春市宏興糧食加工廠；試驗試劑為Na2CO3、三氯乙酸、NaOH、干酪素、酪氨酸、葡萄糖、淀粉、檸檬酸鈉、檸檬酸、福林酚試劑、苯酚、3，5-二硝基水楊酸、對硝基苯酚、異丙醇、Tris-HCl、對硝基苯酚棕櫚酸酯,國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD單人單面凈化工作臺,蘇州凈化設備有限公司； SPX-250BⅢ恒溫培養箱,上海新苗醫療器械制造有限公司； FE28-PH計,梅特勒-托利多儀器有限公司; LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械有限公司；GF-M3000酶標儀,山東高密彩虹分析儀器有限公司； TG16-WS 臺式高速離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的分離純化

采用稀釋平板分離法將樣品按傾注法接種于MRS培養基上培養后挑取菌落形態不同的單菌落轉移至MRS斜面培養基，進行編號后置于4 ℃冰箱保藏。

1.3.2 菌株的篩選

將試管斜面菌株活化后按1%接種量接種于初始pH為6.66大米液體培養基中，適當培養后用pH計測定上清液pH，初篩出產酸能力較強菌株。

將初篩菌株分別采用3,5-二硝基水楊酸比色法[14]、福林酚法[15]、對硝基苯酚法[16]測定淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活性，進行發酵米粉優良菌株的復篩。淀粉酶活定義為1 mL發酵液在40 ℃，pH 5.6條件下5 min內水解1% 淀粉產生1 μg葡萄糖所需酶量為1個酶活力單位(U)；蛋白酶活定義為在40 ℃, 一定pH值條件下, 1 min內催化酪蛋白水解產生1 g酪氨酸所需酶量為1個蛋白酶活力單位 (U)；脂肪酶活定義為在 37 ℃、 pH 8.0條件下，以1 μmol/min釋放對硝基苯酚所需酶量為1個酶活單位(U)。

1.3.3 形態特征及生理生化鑒定

分別將篩選得到的優良菌株劃線接種在MRS瓊脂培養基上，適當條件培養后，觀察菌落大小、顏色、形態、質地、光澤、隆起度、透明度和邊緣結構等群體形態特征；進一步革蘭氏染色，顯微鏡下觀察革蘭氏染色顯色反應、細胞形態和排列方式等菌體形態特征；并對照《伯杰細菌鑒定手冊》[17]《常見細菌鑒定手冊》[18]和API試劑盒檢測進行菌屬初步鑒定。

1.3.4 分子生物學鑒定

采用Bacteria Genomic DNA kit 試劑盒進行菌株基因組DNA提取，采用16S rDNA通用引物序列27F/1492R進行PCR擴增。PCR擴增達到純化要求的產物割膠回收，送往杭州金唯智生物科技有限公司測序。將獲得的序列與NCBI的GeneBank數據庫進行BLAST比對和分析，利用MEGA-X 軟件構建菌株系統發育進化樹。

1.3.5 數據處理及分析

采用SPSS 18.0 對試驗數據進行統計學分析，數據平行3 次，結果用平均值±標準偏差表示，用軟件Origin 8.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選結果

2.1.1 菌株產酸能力

從MRS平板培養基上獲得118株產酸菌株保藏于斜面試管。以pH<4.5為指標，篩選出35株產酸能力較強菌株，如表1所示。由于產酸能力與菌株的生長能力有關，生長速率與所測發酵液pH值呈負相關，因而測定菌株發酵液pH值可反映乳酸菌的發酵性能。表中發酵液中pH最小值為4.12，與初始培養基中pH 6.66相比，發酵液中pH值下降了2.52，pH變化值較大，說明初篩出的菌株具有良好的產酸性能。

表1 不同菌株2 d發酵液pH值Table 1 Different strains in 2 d′s pH value of fermentation broths

2.1.2 菌株產酶活力

35株菌株淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活性如圖1、圖2所示。試驗結果表明,不同菌株產淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活力不同，35株菌株中R112淀粉酶、脂肪酶活性最高分別為210.43、2.15 U/mL，R1212蛋白酶活性最高為9.34 U/mL。所有菌株淀粉酶活性在17.57 ～210.43 U/mL，菌株間淀粉酶活性極差為192.86 U/mL，差異性顯著。但35株菌株中只有27株檢測到了蛋白酶活性，占77.14%，14株檢測到了脂肪酶活性，只占40%。值得注意的是菌株R1212蛋白酶活性最高為9.34 U/mL，淀粉酶活性也具有較高水平為179.71 U/mL，但未檢測到脂肪酶活性，這說明單一菌株產酶能力各有不同，發酵米粉優良菌株的獲得需要結合其他分析方法進一步篩選。

圖1 不同菌株淀粉酶活性Fig.1 Amylase activity of different strains

圖2 不同菌株蛋白酶、脂肪酶活性Fig.2 Protease and lipase activity of different strains

2.1.3 菌株酶活力主成分分析

根據各菌株產淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活性結果，利用SPSS進行主成分分析，并利用Origin繪圖，得到各個菌株主成分得分圖(圖3)。第1主成分方差累積貢獻率為57.09%，主要反映了淀粉酶活性；第2主成分方差累積貢獻率為22.52%主要反映了蛋白酶和脂肪酶活性。得分較高的菌株編號分別為R02、R1212、R29,、R1310、R133、R112、R13。這些菌株相較于其他菌株有較強的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活性。因此最終篩選出發酵性能較好的這7株菌株進行鑒定，為后續試驗奠定基礎。

圖3 菌株篩選主成分得分圖Fig.3 Score of principal components in strain screening

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株形態學鑒定

部分典型菌株形態學鑒定結果如圖4所示，7個菌株分為3種類型。R13、R1212、R02、R1310、R133五個菌株菌落呈圓形、乳白色、表面光滑、凸起、邊緣整齊、不透明，革蘭氏染色為G+、球菌，成對排列或形成四聯狀，無芽孢；菌株R29菌落呈圓形、白色，略有光澤，隆起，邊緣整齊，不透明，革蘭氏染色為G+、桿菌；R112菌落呈圓形，灰白色，不透明，邊緣不整齊，表面粗糙，無光澤，革蘭氏染色為G+、桿菌。

2.2.2 菌株生理生化鑒定

根據各菌株的群體形態和個體形態特點，將疑似乳酸菌的菌株R13、R1212、R02、R1310、R133、R29用API50CHL乳酸菌鑒定系統試劑條輔助進行生理生化鑒定，檢驗菌株對49種碳源的利用能力，將對照作為陰性，底物被利用的反應結果為陽性。在法國梅里埃公司官網上利用API LAB Plus自動判讀系統對試紙條判定結果進行鑒定(表2)。菌株R13、R1212、R02、R1310、R133鑒定為戊糖片球菌，R29鑒定為發酵乳桿菌。將疑似芽孢桿菌菌株R112參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第八版)和《常見細菌系統鑒定手冊》中有關芽孢桿菌的主要生理生化指標進行鑒定，結果如表3所示。根據芽孢桿菌的主要生理生化試驗結果初步判定R112為枯草芽孢桿菌。

A～C-R133、R29和R112菌落形態；D～F-R133、R29和R112顯微鏡檢圖圖4 典型菌落形態及顯微鏡鏡檢圖(×100)Fig.4 Typical colony morphology and microscopic examination

表2 乳酸菌生理生化鑒定Table 2 Physiological and biochemical characteristics of 6 strains

表3 菌株R112生理生化鑒定Table 3 Physiological of biochemical characteristics of Bacillus

2.2.3 16S rDNA基因序列同源性比對與系統發育分析

7菌株16S rDNA PCR擴增產物均為1 000～2 000 bp，條帶清晰明亮(圖5)，其序列測定結果提交GenBank，與已知序列進行比對，并利用軟件MEGA.X進行系統發樹的構建(圖6)。結果表明，菌株R29與發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)位于同一分支,自展值為100%；菌株R133、R02、R1212、R1310、R13與戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)位于同一分支，自展值為65%；菌株編號R112與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)位于同一分支，自展值為63%。各分支自展值均高于50%，根據16S rDNA鑒定結果，并結合形態學、生理生化結果得到各個菌株分子鑒定結果如表4所示，菌株R29為發酵乳桿菌，R133、R02、R1212、R1310、R13為戊糖片球菌，菌株R112為芽孢桿菌屬，并根據生化試驗可以判定為屬于芽孢桿菌屬中第一群中的枯草芽孢桿菌。

表4 菌株同源性分析結果Table.4 Homological analysis of strains

圖5 七菌株16S rDNA PCR產物凝膠電泳圖Fig.5 Seven strains′ gel electrophoresis of 16S rDNA PCR products

3 討論

米粉發酵過程中乳酸菌利用大米中碳水化合物產生乳酸、檸檬酸等有機酸，促進大米中部分蛋白質溶出，使大米淀粉得到純化，提高米粉的力學性質和食用品質；同時有機酸顯著降低大米發酵液pH，抑制其他雜菌生長，提高米粉生產安全性。然而，閔偉紅等[19]研究發現乳酸菌發酵米粉的品質較乳酸大米處理后制成的米粉品質改善更顯著，這說明發酵米粉品質改善不僅是有機酸起作用，可能還與微生物生長代謝的其他產物及其分泌的胞外酶所催化的生化反應等有關。為此，本研究將從樣品中分離得到的118株菌株以產酸能力為首選指標進行發酵米粉優良菌株篩選后獲得35株產酸能力良好的菌株，隨后在考核菌株產酸能力的基礎上以淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活力為指標進行菌株復篩，并通過主成分分析進行綜合評價，獲得了7株優良菌株，經鑒定為戊糖片球菌、發酵乳桿菌、枯草芽孢桿菌3類。

a-乳桿菌16SrDNA基因序列系統發育樹;b-片球菌16SrDNA基因序列系統發育樹;c-芽孢桿菌16SrDNA基因序列系統發育樹圖6 七株菌株系統發育進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of 7 isolated strains based on 16S rDNA sequence

枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌屬，能發酵葡萄糖產酸并產內生孢子的一群芽孢菌?？莶菅挎邨U菌生境多樣，可利用營養物質種類十分豐富，其產生的淀粉酶、蛋白酶在食品工業得到廣泛應用[20-21]，另有研究表明枯草芽孢桿菌通過三羧酸或丙酮酸循環代謝能產生乳酸、丙酮酸等有機酸[22]，已經應用于飼料、食品發酵等多個領域[23]；戊糖片球菌因其益生功能已在發酵蔬菜、乳制品、肉制品領域得到廣泛應用[24], 發酵乳桿菌和枯草芽孢桿菌已有應用于大米發酵中的相關報道[25]，與本研究篩選出的優良菌株一致，但是鮮見開展相關酶活性的研究。本研究篩選出的枯草芽孢桿菌R112產酶活力較強，蛋白酶活性為8.35 U/mL，高于李蕓[26]篩選出的枯草芽孢桿菌蛋白酶活力(3.15 U/mL)，且具有良好的產酸能力和芽孢桿菌抗逆性能抵抗不良外界因素；乳酸菌同時具有淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶多種酶活力，在米粉專用發酵劑研發中有重要價值。

4 結論

本研究從大米發酵液樣品中分離獲得7株具有良好產酸能力以及淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活性的菌株。通過生理生化試驗和16S r DNA分子鑒定得出R133、R02、R1310、R1212、R13共5個菌株為戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)，R29為發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)，R112為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。R02、R29等均可以作為米粉專用發酵劑開發的基礎菌株，但是為了適應于工廠化米粉發酵生產，需要進一步采用育種技術對菌株進行改良研究。