桑葚果園中釀酒酵母的分離鑒定及特性研究

章之柱，尹金彥，孟洋，陳莉，盧紅梅

(貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽，550025)

桑葚是?？浦参锷涞墓?，其口味香甜微酸，營養豐富，富含花青素、硒、VC、多糖、白藜蘆醇等功效成分，具有十分重要的開發利用價值[1-2]。桑葚除了鮮食外，還可加工成果汁、果酒、果脯、酸奶和果醋等多種特色食品[3]。

將桑葚發酵制備成果酒，不僅能增加桑果的附加值，還能解決桑果的季節性過剩、不易儲存等問題[4]。目前，桑葚酒的釀造通常是選用活性干酵母,缺乏專用的酵母。在釀造過程中，酵母菌通過代謝過程去影響桑葚酒的理化性質、風味、口感，進而決定桑葚酒的品質，因此，桑葚果酒釀造酵母的篩選具有十分重要的意義。曹倩雯等[5]從市售桑葚自然發酵后醪液中分離得到 42 株酵母，篩選出 1 株發酵性能良好、風味優良的釀酒酵母 JNB-14；顏雪輝[6]從桑葚鮮果、桑葉等原料純化得到99株酵母菌，經過多級篩選得到能耐受14%的酒精和280 g/L糖，最高產酒精為10.6%，適合桑葚酒發酵的菌株SH1。酵母菌主要分布在偏酸性、含糖高環境中，特別是水果、蔬菜、及果園的土壤中[7]，本實驗從某桑葚果園土壤、桑葉、桑果中分離酵母菌，通過富集培養、純化、TTC顯色培養、酒精發酵等實驗篩選出適宜釀造桑葚果酒的酵母菌,并對其進行相關特性研究，以期為其在桑葚果酒中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚、桑葚葉、土壤,均采集于貴州開陽某桑葚種植基地?；钚愿山湍窧V818,安琪酵母股份公司；活性干酵母SELECTYS LA BAYANUS(SLB),煙臺帝伯仕自釀機有限公司。

葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、瓊脂、wallerstein laboratory nutrient agar(WL)培養基、TTC培養基等生化試劑，上海博微生物科技有限公司；焦亞硫酸鈉，煙臺帝伯仕自釀機有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-5DS11立式壓力蒸汽滅菌器、SN-CJ-IF潔凈工作臺，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SPX-250B智能型生化培養箱，上?，槴\實驗設備有限公司；722S可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母菌的分離、純化

樣品處理：取5 g土樣于無菌試劑瓶，用無菌蒸餾水制成不同質量濃度梯度土壤懸液。取5 g研細桑葉于無菌試劑瓶，用無菌蒸餾水制成不同濃度梯度桑葉懸液。將桑果破碎，取5 mL漿液于無菌試劑瓶，用無菌蒸餾水制成不同濃度梯度桑果漿液[8]。

增殖培養：取0.2 mL不同濃度梯度的桑果漿液、土壤懸液以及桑葉懸液，均勻涂布于酵母浸出胨肽葡萄糖培養基(yeast extract peptone dextrose medium，YPD)，28 ℃恒溫生化培養箱中培養72 h。

分離純化：挑選能夠在YPD上長出來的菌落，初步為酵母菌。在YPD上涂布劃線培養，進一步分離純化酵母菌，28 ℃恒溫生化培養箱中72 h。通過觀察菌落的形態和顏色，進行酵母菌株的初步篩選。對所得的酵母菌進行編號和保藏。

1.3.2 酵母菌初篩

TTC顯色實驗：將純化菌接入TTC上層培養基，28 ℃培養48 h，再在其上覆蓋一層TTC上層培養基，將其28 ℃培養3 h，觀察菌落顏色[9]。產酒精能力越強，菌落紅色越深。選取深紫色菌株進行產氣實驗。

產氣實驗：將顏色深的菌株制成菌懸液，以 5%的接種量接種至帶有杜氏小管的試管中，YPD液體培養基靜置培養，每隔 2 h觀察杜氏小管內氣體的含量，并記錄。淘汰產氣少或不產氣的菌株，選出發酵快、產氣多的菌株進行復篩。

1.3.3 酵母菌復篩

產酒降糖能力篩選：將初篩得到的菌制成菌懸液，按5%的接種量接種到YPD液體培養基，28 ℃培養8 d，參照GB 5009.225—2016《酒中乙醇測定》、GB 5009.7—2016《食品中還原糖測定》測發酵液酒精度和還原糖含量。選取產酒高殘糖低的菌進行下一步篩選。

WL培養分類：將初篩得到的菌接株接種在WL平板，28 ℃倒置培養8 d，觀察菌落形態與顏色，參考文獻[10]，進行初步分類鑒定。

1.3.4 產酒酵母菌的分子生物學鑒定

分子生物學鑒定：將獲得的目的菌株純化送四川擎科梓熙生物技術有限公司測序。以NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)為引物測定酵母菌26S rDNA 的D1/D2可變區序列。

系統發育樹的構建：用基本局部比對搜索工具(basic local alignment search tool，BLAST)將測序結果在美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)中與已知酵母菌的26S rDNA基因序列進行同源性分析，并用MEGA5.10軟件的鄰接法(Neighbor-Joining)，構建系統發育樹，具體確定菌株的種屬。

1.3.5 酵母菌發酵特性研究

菌種活化。將分離得到的菌株接種于YPD液體培養基中，28 ℃培養24 h,得到酵母菌懸液。

生長曲線測定。取菌懸液，按5%的接種量接種于含有無菌YPD液態培養基錐形瓶中，并放置在28 ℃、150 r/min的恒溫振蕩器內培養。做3個平行，以YPD液體培養基為空白，每隔2 h取出培養液，測定培養液OD600值，繪制生長曲線[11]。

最適生長溫度測定。按5%的接種量接種于含有無菌YPD液態培養基錐形瓶中，150 r/min的恒溫振蕩器內培養。培養溫度分別設置為26、28、30、32、34、37 ℃。做3個平行，以YPD液體培養基為空白，培養30 h取出培養液，測定培養液OD600值，記錄數據。

適宜生長pH的測定。取菌懸液，按5%接種量分別接入pH 2.5、3.5、4.5、5.5和6.5的YPD培養基中，最適溫度培養30 h，測定培養液OD600值，確定其適宜pH值。

SO2耐受性能測定。取菌懸液，按5%的接種量接種于無菌YPD液態培養基錐形瓶中，加入除菌的焦亞硫酸鉀調節培養基中SO2濃度，使其終濃度分別為50、100、200、400、600、800 mg/L，最適溫度下培養30 h。做3個平行，以YPD液體培養基為空白，測定培養液OD600值，記錄數據。分析所選酵母菌對SO2的耐受性[12]。

乙醇耐受性能測定。取菌懸液，按5%的接種量分別接種于添加無水乙醇體積分數為6%、8%、10%、12%、14%的無菌YPD液態培養基錐形瓶中，在最適溫度下培養30 h。做3個平行，以YPD液體培養基為空白，測定培養液OD600值。

1.3.6 釀酒酵母釀造桑葚果酒揮發性風味物質分析

桑葚果酒的釀造。將新鮮桑葚榨汁過濾，用蔗糖調糖度為22 °Brix，75 ℃巴氏殺菌15 min加入質量濃度為80 mg/L的偏重亞硫酸鉀，5%接種量在最適生長溫度恒溫發酵7 d[4-5]。同時，用安琪釀酒酵母BV818和帝伯仕SLB作對比。利用頂空固相微萃取-氣質聯用方法分析桑葚酒的風味成分。固相微萃?。喝? mL樣品置于20 mL頂空瓶中，加入2-辛醇作內標，將老化后的50/30 μmCAR/PDMS/DVB萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于45 ℃吸附30 min，吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進樣口，于250 ℃解吸3 min，同時啟動儀器采集數據。GC條件：色譜柱為DB-WAX， 30 m×0.25 mm×0.25 μm,柱溫：起始溫度 40 ℃，保持 3 min，然后以 5 ℃/min 升至100 ℃，再以 10 ℃/min 升至 230 ℃，保持 6 min；載氣氦氣；流速0.8 mL/min；進樣口溫度250 ℃。MS 條件：電離方式為EI+，電子能量 70 eV，接口溫度 250 ℃，離子源溫度 200 ℃，檢測器電壓1 000 V。通過計算機檢索與NIST 14 Library相匹配，選擇較高匹配度的檢索結果確認檢測物成分。各化合物的相對含量根據內標物2-辛醇利用歸一化法進行計算得到。

1.3.7 數據處理與分析

所得數據通過Office 2007，SigmaPlot 14.0、Design-Expert、SPSS 22.0等軟件進行處理，作圖。

2 結果與分析

2.1 酵母菌的分離純化及初篩

經過增值培養，分離純化，從桑葉、桑果、土壤中中共篩選得到74株疑似酵母菌株，編號為Y1～Y74。

74株純化的菌株進行TTC顯色反應，其中11株呈深紅色，22株呈紅色，22株顯淺紅色，其余不變色。將11株深紅色菌進行產氣實驗，其結果見表1。由表1可知，菌株Y1、Y2、Y8、Y22、Y39、Y41產氣時間較早，均在6 h內開始產氣；菌株Y1、Y8、Y41、Y42產氣較快，在培養了16 h后氣體充滿了杜式小管。綜合起始產氣時間、小管滿氣時間，選擇菌株Y1、Y2、Y8、Y22、Y39、Y41、Y42進行復篩。

表1 產氣實驗結果Table 1 Result of product gas experiments

2.2 酵母菌的復篩結果

初篩得到的菌株YPD液體培養7 d后，測發酵液中乙醇和還原糖含量，由圖1可知，菌株Y2、Y8、Y39產酒精能力很好，均超過10%vol，培養基利用率高，殘余還原糖含量低，分別為1.3、 1.3、 1.4 g/L。將初篩選到的7株菌進行WL培養，菌株WL培養分類結果如表2所示。參照文獻楊雪峰等[10]對菌落形態和顏色進行描述，將其分為5類。

圖1 不同菌株產酒精能力和糖消耗能力Fig.1 Alcohol production capacity and sugar consumption capacity of different strains

表2 酵母菌株WL菌落形態描述Table 2 The description of yeast species on WL medium

酵母菌株的WL培養特征如圖2所示。根據楊雪峰等[10]的研究,畢赤酵母呈白色帶淡綠色、表面粗糙有褶皺、中央有火山狀凸起，觀察到菌株Y1外表粗糙、有明顯褶皺、中間乳白色、四周灰綠色、有錐形突起，初步判定Y1為畢赤酵母；釀酒酵母的形態特征為奶油色帶綠色、有球狀突起、光滑不透明，菌株Y2表面光滑不透明、中間呈淡綠色、四周淡黃色，菌株Y41與Y42邊緣為奶油狀、中間翠綠色、有球狀突起，初步判定Y2、Y41、Y42為釀酒酵母；假絲酵母的形態特征為表面光滑、中央乳白色、邊緣綠色，菌株Y8、Y22和Y39菌落光滑、呈乳白色、邊緣帶有淡綠色或有菌絲，初步判定菌株Y8、Y22和Y39為假絲酵母。結合發酵特性，選擇產酒能力好的菌株Y2進行鑒定。

A-Y1；B-Y2；C-Y8、Y22；D-Y39;E-Y41、Y42圖2 酵母菌株在WL培養基上的菌落特征Fig.2 Colony morphotypes of yeast species on WL medium

2.3 酵母菌的分子生物學鑒定結果

菌株Y2 26S rDNA D1/D2區的擴增產物條帶如圖3-a所示。目的條帶清晰無雜帶，片段大小在500 bp左右。將測序所得的酵母菌Y2的 26S rDNA D1/D2序列輸入NCBI進行BLAST同源比對。結果顯示，菌株Y2與釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeA57同源性最高，達到100%。將菌株Y2 與NCBI數據庫中已知酵母進行序列比對，并構建系統發育樹(圖3-b)。從系統發育樹來看，菌株Y2與釀酒酵母的親緣關系最近。結合其形態學特點,該菌為釀酒酵母Saccharomycescerevisiae。

a-電泳圖；b-系統發育樹圖3 菌株26S rDNA D1/D2序列擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖和Neighbor-Joining法繪制的系統發育樹Fig.3 Agarose gel electrophoretogram of Y2 strain 26S rDNA D1/D2 sequences amplifying product and the phylogenetic tree by Neighbor-Joining

2.4 產酒酵母菌的發酵特性

2.4.1 菌株Y2的生長曲線測定

以時間為橫坐標，菌液OD600為縱坐標，繪制菌株Y2生長曲線(圖4)。由圖4可知，在0～2 h內，菌體數量增長緩慢，為延遲期；在2～10 h內，菌液OD600值迅速增加，為對數期；而10～40 h增長變得緩慢，為穩定期；40 h后菌液OD600值幾乎保持穩定不變，達到最大值，菌株Y2生長停滯，進入衰亡期。

圖4 菌株Y2的生長曲線Fig.4 Growth curve of strain Y2

2.4.2 pH和溫度對菌株Y2生長的影響

發酵過程中，酵母菌需要在一個適宜的條件下才能獲得最佳生長，提高生產效率。pH、溫度、乙醇、糖度、SO2等都影響菌的生長。由圖5-a可知，培養基中pH從2.5增大到3.5時，菌液OD600隨pH增大而上升；而當pH>3.5后，出現下降趨勢。在pH為3.5時，菌液OD600達到最大值，菌株Y2生長得最好，說明其最適pH為3.5。同時，可以看出，當pH<3.5時，pH對菌株生長影響較大；相比之下在3.5～6.5時，pH變化對菌生長影響較小。溫度對酵母菌Y2生長的影響如圖5-b所示，隨著培養溫度的增加，菌液的OD600值呈現先增加后下降的趨勢，當培養溫度為28 ℃ 時，菌液OD600值達到最大；繼續升高培養溫度，菌液OD600值隨培養溫度的升高而逐漸減小，故28 ℃為菌株Y2最適生長溫度。

a-pH; b-溫度圖5 pH和溫度對菌株Y2生長的影響Fig.5 Effects of pH and temperature on the growth of strain Y2

2.4.3 菌株Y2耐受性研究

根據行業標準NY/T1508—2017《綠色食品 果酒》中規定果酒的酒精度為7%vol～18%vol。果酒的發酵菌株需要對酒精度具有較高的耐受性，才能夠生產出符合標準的產品。菌株Y2乙醇耐受性如圖6-a所示。隨著乙醇體積分數增大，菌液OD600逐漸減小。當乙醇體積分數為6%、8%、10%時，菌株Y2仍然能夠較好生長，達到一定OD600；而乙醇體積分數為12%、14%，菌株被明顯抑制。說明菌株Y2最高能耐受約12%的乙醇。

果酒生產中常常添加SO2來抑制雜菌的生長和繁殖，保證主要生產菌株的發酵優勢[13]。NY/T1508—2017規定的果酒中SO2最高添加量為400 mg/L。菌株Y2在不同質量濃度SO2條件下的生長情況如圖6-b所示。由圖6可知，隨著SO2質量濃度增大，菌液OD600逐漸減小。說明SO2質量濃度越大，對菌株Y2的抑制作用越強。當SO2質量濃度為800 mg/L時，菌株Y2仍然可以生長，表明菌株Y2具有較強的耐SO2能力。

a-酒精度;b-SO2圖6 菌株Y2對酒精度和SO2的耐受性Fig.6 Ethanol and SO2 tolerances of strain Y2

2.4.4 菌株發酵桑葚酒揮發性風味物質分析

揮發性風味物質是評價果酒品質的重要指標[4]。采用頂空固相微萃取-氣質聯用方法對3株酵母發酵的桑葚酒進行風味物質檢測和分析，比較菌株Y2與釀酒酵母SLB、BV818的差異。不同菌株發酵桑葚酒風味物質相對含量如表3所示。

由表3可知，3株酵母發酵的桑葚酒中共檢出79種揮發性風味物質，包括酯類26種、醇類17種、酸類11種、酮類9種、醛類8種、其他8種。菌株Y2發酵桑葚酒中檢測出風味物質56種，BV818為52種，SLB為 53種，三者共有風味物質32種，占總風味組分的40.51%。

表3 不同菌株發酵桑葚酒揮發性風味物質相對含量 單位：%

續表3

將3株酵母發酵的桑葚酒風味物質用SPSS 22.0 進行主成分分析。由表4可知，主成分1的貢獻率為57.656%，主成分2貢獻率為42.344%，能代表風味物質特征。

表4 主成分的特征值和貢獻率Table 4 Eigenvalues of principal components and their contribution to total variance

不同菌株釀造桑葚酒揮發性風味物質主成分分析如圖7所示。由圖7-a可知，第1主成分主要與乙酸異戊酯(A4)、乙酸己酯(A10)、辛酸丁酯(A7)、己酸異丁酯(A9)等酯類成顯著正相關，與月桂酸(B10)、橙花叔醇(C16)、對二甲苯(E3)等成顯著負相關；第2主成分主要與乙酸苯乙酯(A19)、乙酸(B1)、苯甲醛(D5)等成顯著正相關，與辛酸乙酯(A13)、正丁醇(C4)、異戊醇(C5)等成顯著負相關。從圖7-b不同菌株發酵桑葚酒得分圖可知菌株Y2、BV818發酵桑葚酒與第1主成分有很高的負相關，菌株SLB發酵桑葚酒與第1主成分有很高的正相關；而菌株Y2發酵桑葚酒與第2主成分呈很高的正相關，菌株SLB、BV818發酵桑葚酒與第2主成分呈負相關。3株菌分布在不同的象限，反映出3種菌株發酵桑葚酒風味的差異與特點。

a-載荷圖;b-得分圖圖7 桑葚酒揮發性風味物質主成分分析圖Fig.7 PCA of the flavor components in mulberry wine

不同酵母發酵的桑葚酒中各類風味物質含量如圖8所示。3種桑葚酒中各類風味物質相對含量從高到底依次為醇類、酯類、酸類、酮醛類、其他。酯類、醇類、酸類、醛類、酮類等風味物質的含量和比例賦予了果酒獨具特色的香氣和風格。

圖8 不同酵母發酵桑葚酒各類風味物質相對含量Fig.8 Relative contents of various flavor substances in mulberry wine fermented by different yeasts

菌株Y2、SLB、BV818發酵桑葚酒中醇類物質含量分別為75.60%、78.11%、81.55%，是桑葚酒中的主要香氣成分。不同菌株發酵桑葚酒中醇類物質含量較高的物質均為乙醇、異戊醇、異丁醇、苯乙醇。異戊醇賦予桑葚酒濃郁的果香、花香、略帶辛辣的白蘭地酒香味；異丁醇具有雜醇味、威士忌香味；苯乙醇則具有玫瑰花香，它們使得桑葚酒風味濃郁優雅、層次豐富[14]。

菌株Y2、SLB、BV818發酵桑葚酒中酯類物質含量分別為18.74%、16.11%、13.61%，酯類物質來自于發酵過程中醇類和?；o酶A的縮合反應,通常賦予果酒新鮮的水果香味[15]。3株酵母發酵的桑葚酒中酯類的種類和含量差異顯著。菌株Y2中乙酸乙酯含量最高，其次是辛酸乙酯、癸酸乙酯；BV818和SLB中含量最高的則是辛酸乙酯、其次是癸酸乙酯、乙酸乙酯。乙酸乙酯和癸酸乙酯具有令人愉快的果香味，乙酸乙酯帶有櫻桃味、葡萄味，癸酸乙酯則具有草莓味[16]。辛酸乙酯賦予桑葚酒奶香、甜香、臘味。桑葚酒風味不僅受單一的酯類物質含量影響，還與各種酯類的累加效應有關[17]。3種酵母發酵桑葚酒產生不同種類和含量的酯類物質，使得3種桑葚酒酒體果香各異，風格突出。

菌株Y2、SLB、BV818發酵桑葚酒中酸類物質含量分別為2.21%、1.69%、2.39%。酸類物質在果酒中常常起到平衡、協調其他香味的作用。3種桑葚酒中酸類物質含量較高的成分是乙酸、辛酸和癸酸。菌株Y2、SLB發酵的桑葚酒中含量最高酸類物質的是乙酸，BV818則是辛酸。乙酸在果酒中呈辛辣味、辛酸和癸酸分別帶有脂肪味、肥皂味[18]。酸類含量少時，桑葚酒清淡味短，而含量過高時則酒體粗糙濃烈，適宜的酸含量對桑葚酒主體風味很重要[19]。

菌株Y2、SLB、BV818發酵桑葚酒中醛酮及其他類風味物質含量很低，均<1%，但對桑葚酒風味也有一定的貢獻。乙醛、癸醛、2,3-戊二酮、乙酐、2-壬酮等為菌株Y2、SLB、BV818發酵桑葚酒中共有的物質，正辛醛、苯甲醛、苯乙酮、苯乙烯為菌株Y2產生的特有風味物質。其中2,3-戊二酮帶有焦糖味、烤香味；乙醛、乙酐具有辛辣味；苯甲醛則帶有杏仁味、堅果香[20]。

3 結論

理想的桑葚酒酵母，需要良好的發酵性能，較強的耐受能力，協調豐富的產香性能。本研究從桑葚基地土壤、桑葉、桑果中分離篩選出74株酵母。通過發酵性能和耐受性篩選得到1株酵母菌株Y2。經WL培養及26S rDNA序列分析，鑒定其為釀酒酵母Saccharomycescerevisiae。

菌株Y2最適培養溫度為28 ℃，最適pH為 3.5，在體積分數12%乙醇和質量濃度800 mg/L SO2條件下仍然可以保持良好的生長。搖床培養32 h到達最大生長濃度，40 h后開始進入衰亡期。

菌株Y2發酵桑葚酒揮發性風味物質與商業釀酒酵母BV818、SLB相比各具特色，經主成分分析發現3種桑葚酒分布在不同區域，風格各異。菌株Y2發酵桑葚酒風味物質種類比BV818、SLB分別多4種、3種。從相對含量來講，菌株Y2發酵桑葚酒醇類物質分別比BV818、SLB低2.51%、5.95%；而酯類物質比BV818、SLB高2.63%、5.13%；酸類物質比BV818高0.52%、比SLB低0.18%。與BV818、SLB 2株商業釀酒酵母相比，菌株Y2產醇能力相近，產酯能力較優，產酸能力適中。酯類物質多帶有水果、花香，且閾值較低，相互作用能產生特殊風味，菌株Y2發酵桑葚酒風味也更加優良，香氣更加馥郁。

在本實驗基礎上，后續研究將進行桑葚酒發酵條件優化與探索，為桑葚酒產品開發奠定理論基礎，進而促進桑葚酒品質的提升及品類的豐富。