番石榴多酚的提取純化及其抑菌活性研究

周濃，莫日堅，黃秋艷，李承勇,3*

1(廣東海洋大學 食品科技學院，廣東 湛江，524088)2(廣東海洋大學 深圳研究院，廣東 深圳，518100) 3(廣東海洋大學 化學與環境學院，廣東 湛江，524088)

番石榴(PsidiumguajavaLinn.)，俗稱芭樂、雞屎果，原產于南美洲，在中國華南各地均有栽培，是一種營養價值較高的熱帶水果[1-3]。番石榴的VC含量明顯高于其他水果，可達1 000 mg/100g[4]。番石榴還具備藥用效果，可以起到止血、止痢、止癢、清肝等功效[5-6]。番石榴含有的活性成分主要有多酚、黃酮、鞣質類、萜類、甾體類等，其活性物質具有降血糖、抗氧化、抑菌及預防慢性病等作用[7-8]。ALMULAIKY等[9]對2種品種的番石榴進行研究，發現2種番石榴均顯示抗氧化活性。FLORES等[10]對7種番石榴多酚化合物進行抗氧化活性研究，結果表明不同品種番石榴的抗氧化活性有很大差異。

植物多酚具備抗氧性，抗炎性和抗菌性等生物特性。比如茶多酚可以促進動物的順利生產，還能通過調節動物的腸道狀況提高其免疫能力，在獸醫學方面有應用前景[11]。蘋果多酚作為天然安全活性物質，不僅可以保護肝細胞，還對小鼠的糖尿病有明顯的改善作用[12]。植物多酚的提取有多種方法，其中溶劑萃取法是最為原始的方法，但是因為耗時長，且得率不穩定，所用的有機溶劑易污染環境，已逐漸被新方法所淘汰。微波提取相對于溶劑萃取提取率高，無環境污染，且設備便宜，被廣泛應用，但是使用時要注意安全問題。超臨界流體萃取是新型的現代高效環保的提取方法，但是成本昂貴，不適宜用于工業化生產植物多酚[13]。相比之下，超聲波輔助提取因為操作方便，提取時間短且得率高穩定等優點，得到廣泛應用。本文采用超聲波輔助技術提取番石榴多酚，通過試驗優化其提取的最佳工藝及條件，選用AB-8大孔樹脂純化，將純化后的番石榴多酚進行抑菌活性研究，為番石榴多酚的綜合開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番石榴，湖光農貿市場；沒食子酸、福林酚試劑、Na2CO3、無水乙醇(均為分析純)，廣州左克生物科技發展有限公司；營養瓊脂、馬鈴薯葡萄瓊脂(PDA)，北京陸橋技術股份有限公司；AB-8大孔樹脂，廊坊圣泉化工有限公司。

1.2 儀器與設備

超聲波清洗器(KQ-500E)，昆山市超聲儀器有限公司；真空冷凍干燥機(LGJ-12)，廣州吉迪儀器有限公司；旋轉蒸發器(RE-3000B)，鞏義市宏華儀器設備工貿有限公司；循環水真空泵(SHZ-Ⅲ)，上海亞榮生化儀器廠；紫外可見分光光度計(U3900H)，天美科技有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-50KBS)，上海申安醫療器械廠。

1.3 標準曲線的繪制

按照文獻[14]報道的，稱取沒食子酸標準品0.025 g，加入蒸餾水溶解，用500 mL容量瓶定容得質量濃度為0.05 mg/mL沒食子酸標準溶液。準確吸取0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8 mL沒食子酸標準溶液分別置于50 mL棕色容量瓶中，加入4 mL福林酚試劑，搖勻，加入4 mL的10% Na2CO3溶液，充分混勻后定容，室溫靜置反應1 h，于760 nm波長處測吸光度，不加沒食子酸標準溶液為空白對照組。以吸光度值(y)為縱坐標，反應體系中沒食子酸的質量濃度(x)為橫坐標，繪制標準曲線，為y=0.120 4x-0.002 3，R2=0.998 5。

1.4 番石榴多酚含量的測定

選取新鮮番石榴切塊打漿并進行真空冷凍干燥。干燥后，將其粉碎并過60目篩獲得所需的番石榴粉。準確稱取番石榴粉1 g于100 mL帶塞錐形瓶中，在一定提取條件下，用一定濃度的乙醇浸提番石榴多酚，提取液過濾，5 000 r/min離心7 min，吸上清液用一定濃度的乙醇定容到100 mL，再吸取1 mL定容后的溶液按照沒食子酸標準曲線的繪制方法測定番石榴多酚含量。根據公式(1)計算番石榴多酚得率：

(1)

式中：C1，被測溶液中多酚的質量濃度，mg/mL；V1，被測溶液的體積，mL；N，稀釋的倍數；M，番石榴粉質量，g。

1.5 番石榴多酚提取單因素試驗

1.5.1 料液比的選擇

準確稱取1 g番石榴粉于帶塞100 mL錐形瓶中，按料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 (g∶mL)加入50%(體積分數)乙醇溶液，在50 ℃超聲提取40 min?？疾炝弦罕葘Ψ穸喾拥寐实挠绊?。

1.5.2 超聲提取溫度的選擇

準確稱取1 g番石榴粉于100 mL帶塞錐形瓶中，按料液比1∶20 (g∶mL)加入50%乙醇溶液，分別在30、40、50、60、70 ℃下超聲提取40 min?？疾斐曁崛囟葘Ψ穸喾拥寐实挠绊?。

1.5.3 超聲提取時間的選擇

準確稱取1 g番石榴粉于100 mL帶塞錐形瓶中，按料液比1∶20 (g∶mL)加入50%乙醇溶液，在50 ℃下分別超聲提取30、40、50、60、70 min?？疾斐曁崛r間對番石榴多酚得率的影響。

1.5.4 乙醇體積分數的選擇

準確稱取1 g番石榴粉于100 mL帶塞錐形瓶中，按料液比1∶20 (g∶mL)分別加入30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇，在50 ℃下超聲提取40 min?？疾煲掖俭w積分數對番石榴多酚得率的影響。

1.6 番石榴多酚提取響應面試驗設計

在單因素實驗的基礎上，選取乙醇體積分數、超聲溫度、料液比和超聲提取時間為試驗因素，設計4因素3水平試驗，結果見表1。

表1 響應面因素水平表Table 1 Response surface factor level table

1.7 番石榴多酚分離純化

采樣AB-8大孔樹脂濕法裝柱(柱子規格20 mm×600 mm，柱體積100 mL)，將番石榴多酚粗品配成1.2 mg/mL的上樣液過柱子進行純化。純化條件：樣液pH為4，樣液流速1 mL/min，蒸餾水除雜，80%乙醇洗脫，洗脫流速2 mL/min，直至流出液體不含有多酚類化合物[15]。將純化后收集的溶液濃縮干燥成粉末，測定番石榴多酚含量，根據公式(2)計算番石榴多酚純度：

(2)

式中：C2，為純化后收集液多酚的濃度，μg/mL；V2，為純化后收集液多酚的體積，mL；W多酚物干重，g。

1.8 番石榴多酚抑菌活性的測定

按照文獻[16]報道的，在無菌工作臺中從斜面培養基上挑取1環已活化好的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉以及假絲酵母菌體，分別接入30 mL生理鹽水中，充分搖勻，使各菌懸液的菌細胞數達到106～107CFU/mL備用，且菌懸液當天使用。

將純化后的番石榴多酚用60%乙醇配制成質量濃度為6 mg/mL溶液，利用二倍稀釋法配成6、3、1.5、0.75、0.375 mg/mL共5個濃度梯度的番石榴多酚溶液。將直徑為6 mm的無菌圓形濾紙片分別浸泡在不同濃度的多酚溶液，以及滅菌后的生理鹽水和60%乙醇溶液中120 min以上。

在無菌環境下，往培養皿中倒入10 mL培養基，培養基凝固成平板后，取1 mL菌懸液加入到平板中(細菌加入到營養瓊脂培養基，酵母和霉菌加入到PDA固體培養基)，用涂布棒使菌液均勻分布，不同菌種做好標記。用無菌鑷子取出浸泡后圓形濾紙片，貼于平板中，把分別浸泡于不同濃度番石榴多酚溶液，生理鹽水和乙醇溶液的濾紙片做好標記。將標記好的平板在一定溫度下培養一段時間(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌于37 ℃下培養24 h，黑曲霉和假絲酵母在28 ℃下培養48 h)，觀察菌體的生長狀況，測量并記錄抑菌圈的直徑大小，每個樣品平行實驗3次。根據抑菌圈的大小判斷抑菌活性的好壞，無抑菌圈的多酚濃度為其最低抑菌濃度(minimum inhitory concentration，MIC)，生理鹽水為空白組，60%乙醇溶液為對照組。

1.9 數據處理

單因素試驗數據采用OrigingPro 8進行處理，帶標準偏差作圖。響應面試驗數據采用Design Expert 10中Box-Behnken組合法進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 番石榴多酚提取單因素試驗結果與分析

2.1.1 料液比對番石榴多酚提取率的影響

由圖1可知，隨著料液比的增大，多酚得率先上升后下降?？赡苁窃龃罅弦罕?，番石榴粉與溶劑的接觸面增大，多酚得率增加。當料液比為1∶30(g∶mL)時多酚得率最高，然后隨著料液比的增大多酚得率下降?？赡苁钱斄弦罕葹?∶30(g∶mL)時多酚物質已經基本被提取出來，再增加溶劑會讓番石榴多酚中其他雜質被釋放出來，且料液比過大會浪費溶劑。因此選用料液比為1∶25、1∶30、1∶35 (mg∶mL)做響應面優化試驗。

a-水作溶劑;b-乙醇作溶劑圖1 料液比對多酚得率的影響Fig.1 Effect of feed-to-liquid ratio on polyphenol yield

2.1.2 提取時間對番石榴多酚提取率的影響

由圖2可知，隨著提取時間的延長，番石榴多酚得率上升。當提取時間為60 min時，番石榴多酚得率達到最大值，然后隨著提取時間的延長，番石榴多酚得率下降?？赡苁情_始隨著提取時間延長，番石榴多酚逐漸從組織中被釋放出來，但隨著提取時間的不斷延長，多酚物質已經基本被提取出來，且在提取過程中多酚與空氣接觸，被氧化破壞，多糖等其他物質也會被提取出來，導致多酚得率降低。因此選擇提取時間為50、60、70 min做響應面優化試驗。

a-水作溶劑;b-乙醇作溶劑圖2 提取時間對多酚得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on multi-part yield

2.1.3 提取溫度對番石榴多酚提取率的影響

由圖3可知，隨著提取溫度的升高，番石榴多酚得率升高。當溫度提取為50 ℃時番石榴多酚得率達到最大值，然后隨著提取溫度的繼續上升，番石榴多酚得率下降?？赡苁请S著提取溫度的升高可促使多酚與蛋白質等物質結合穩定性下降，從細胞中釋放出來，但是溫度過高也會導致多酚被氧化或者降解[17]。因此選擇提取溫度為40、50、60 ℃做響應面優化試驗。

a-水作溶劑;b-乙醇作溶劑圖3 提取溫度對多酚得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on polyphenol yield

2.1.4 乙醇體積分數對番石榴多酚提取率的影響

由圖4可知，隨著乙醇體積分數的增加，番石榴多酚得率上升。乙醇體積分數為50%時番石榴多酚提取率最高，然后隨著乙醇體積分數的繼續增加，多酚得率下降。推測是體積分數為50%的乙醇與番石榴組織內多酚極性相近，有利于番石榴多酚被提取出細胞外，當乙醇體積分數繼續增加，溶劑極性增大，葉綠素等雜質更容易被釋放，導致多酚得率降低[18]。因此選擇乙醇體積分數為40%、50%、60%做響應面優化試驗。

圖4 乙醇體積分數對多酚得率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on polyphenol yield

綜合以上分析可知，在單因素試驗中，水與乙醇分別作為提取溶劑，其他提取條件相同，乙醇作為提取溶劑實驗組多酚得率最大值均高于水提取溶劑實驗組，因此選擇乙醇作提取溶劑進行響應面試驗。

2.2 番石榴多酚提取響應面優化試驗結果與分析

2.2.1 響應面試驗結果與分析

對表2數據進行分析處理，得到番石榴多酚得率(Y)對自變量乙醇體積分數(A)，料液比(B)，提取時間(C)，提取溫度(D)四個因素的二次多項回歸方程為：

表2 響應面結果Table 2 the results of response surface

Y=-74.450 8+0.855 9A+1.409 0B+0.733 0C+0.740 6D+0.001 2AB-0.002 1AC+0.000 6AD-0.003 4BC-0.002 3CD+0.001 5BD-0.007 8A2-0.018 2B2-0.005 0C2-0.007 8D2

根據方差分析表3中F值和P值可以判斷各因素對番石榴多酚得率的影響：料液比(B)>提取溫度(D)>乙醇濃度(A)>提取時間(C)。各因素中A、B、D對番石榴多酚得率影響達到極顯著水平，自變量C以及交互項AB、AD、BD、CD對番石榴多酚得率影響不顯著，交互項AC、BC對番石榴多酚得率影響顯著，二次項A2、B2、C2、D2均對多酚得率影響極顯著。

表3 響應面回歸模型方差分析表Table 3 Response surface regression model variance analysis table

2.2.2 響應面試驗各因素交互作用分析

各因素對番石榴多酚得率影響的響應面曲線圖和等高線圖如圖5所示。由圖5-a和圖5-b可知，響應面圖中乙醇體積分數和料液比曲線比較陡且存在最高點，此外，其等高線呈橢圓形，這說明乙醇體積分數和料液比對多酚得率都有較大的影響，兩者之間的交互作用對多酚得率的影響較大。圖5-c和圖5-d為乙醇體積分數和提取時間交互作用對番石榴多酚得率影響的響應面曲線圖和等高線圖。隨著乙醇體積分數和提取時間的增加，乙醇體積分數和提取時間曲線比較陡且存在最高點，等高線為橢圓形，說明乙醇體積分數和提取時間對多酚得率都有較大的影響，兩者之間的交互作用對多酚得率的影響較大。如圖5-e和圖5-f所示，響應面圖中乙醇體積分數和提取溫度曲線存在頂點，但等高線為圓形，這說明乙醇體積分數和提取時間的交互作用對多酚得率的影響不大。料液比和提取時間對番石榴多酚得率影響的響應面曲線和等高線如圖5-g和圖5-h所示，曲線比較陡且存在最高點，等高線呈橢圓形，說明料液比和提取時間對多酚得率都有較大的影響，兩者之間的交互作用對多酚得率的影響較大。圖5-i和圖5-j為料液比和提取溫度對番石榴多酚得率影響的響應面曲線圖和等高線圖，由圖可知，曲線比較陡且存在最高點，等高線呈橢圓形，說明料液比和提取溫度對多酚得率都有較大的影響，兩者之間的交互作用對多酚得率的影響較大。由圖5-k和圖5-l可知，響應面中提取時間和提取溫度曲線比較陡，存在最高點，并且等高線呈橢圓形，這說明提取時間和提取溫度對多酚得率都有較大的影響，兩者之間的交互作用對多酚得率的影響較大。

圖5 各因素交互作用對番石榴多酚得率的等高線和響應面Fig.5 Contour line and response surface of guava polyphenol yield by interaction of various factors

利用Design Expert 10.0 預測得到番石榴多酚提取的最佳工藝條件為：乙醇體積分數為50.98%，料液比為1∶31.59，提取時間為60.05 min，提取溫度為50.73 ℃。在此工藝條件下，番石榴多酚得率為10.40 mg/g。

2.3 最佳提取工藝及驗證實驗結果

通過整理分析得出的番石榴多酚最佳工藝條件將最佳提取工藝條件確定為乙醇體積分數51%，料液比1∶32，提取時間60 min，提取溫度51 ℃。對最佳提取工藝條件進行實驗驗證，重復實驗3次，得到番石榴多酚平均得率為10.31 mg/g，與模型預測值誤差為0.865%，說明該模型較準確地預測番石榴多酚實際得率。

2.4 大孔樹脂純化結果與分析

番石榴多酚粗品純度為1.2%，經AB-8大孔樹脂純化后番石榴多酚純度達到33.2%，嘗試將番石榴多酚液體過XAD-16大孔樹脂純化[19]，嘗試結合金屬離子沉淀法[20]以及利用聚酰胺樹脂進行二次純化[21]，均不能提高番石榴多酚純度，原因可能是番石榴多酚進行一次純化后被提取出來，進行二次純化暴露時間過長，難免與空氣中氧氣接觸，番石榴多酚被氧化降解。

2.5 抑菌活性測定結果

番石榴多酚表現出抑菌效果可能因為多酚抑制菌體體內某些酶的合成，影響其代謝，也可能是多酚物質與蛋白質結合，或者與其他微生物生長必須物質結合，導致微生物死亡等[22]。由表4可知，番石榴多酚對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌以及大腸桿菌有抑菌作用，且高濃度多酚溶液抑菌效果更強。番石榴多酚對金黃色葡萄球菌抑菌效果最好，在同濃度多酚溶液中抑菌圈最大，其次是枯草芽孢桿菌，對大腸桿菌的抑制效果相對于前2種較弱?？莶菅挎邨U菌以及金黃色葡萄球菌的MIC為1.5 mg/mL，對應抑菌圈分別為(7.54±0.06) mm，(7.87±0.05) mm。大腸桿菌MIC為3 mg/mL，對應抑菌圈大小為(7.68±0.04) mm。然而，6 mg/mL的番石榴多酚對黑曲霉和假絲酵母沒有抑菌作用，可能的原因是6 mg/mL的濃度未達到它們的最低抑菌濃度，當實驗濃度超過它們的最低抑菌濃度時，也會有一定的抑菌作用?？钻柕萚23]的研究顯示，當石榴皮粗提物的質量濃度為20 mg/mL時，黑曲霉和假絲酵母的抑菌圈分別為6.0 mm 和16.0 mm。

表4 番石榴多酚抑菌活性測定結果 單位：mm

通常情況下，番石榴多酚對革蘭氏陽性(G+)菌的抑制作用比對革蘭氏陰性(G-)菌的抑制作用強。鄺高波[24]的研究發現番石榴多酚對G+菌的抑制作用明顯高于對G-的抑制作用。梁清蓉[25]研究發現番石榴葉酚類對G+菌的抑制作用明顯比G-菌的抑制作用強。本研究的結果與以上兩個研究小組的結果相似，番石榴多酚對2株G+菌的MIC為1.5 mg/mL，對1株G-菌的MIC為3 mg/mL，說明番石榴多酚對G+菌的抑菌作用優于G-菌。這歸因于番石榴多酚能特異性地凝固細菌蛋白、破壞細菌細胞膜結構，與細菌遺傳物質DNA結合，從而抑制細菌的生長[26-27]。

3 結論

通過單因素和響應面優化試驗探索番石榴多酚提取工藝，得到其最佳提取工藝條件：乙醇體積分數為51%，料液比為1∶32(g∶mL)，提取時間為60 min，提取溫度為51 ℃。在此工藝條件下，番石榴多酚得率為10.31 mg/g。利用AB-8大孔樹脂對番石榴多酚粗品進行分離純化，番石榴多酚純度由1.2%提高到33.2%，提高了27.7倍。通過番石榴多酚抑菌活性測定分析，發現番石榴多酚對大腸桿菌，枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌具有抑制作用，它們的MIC分別為3、1.5、1.5 mg/mL，但是對假絲酵母和黑曲霉無抑菌作用。研究表明，番石榴多酚具有抑菌作用的藥效物質基礎，下一步將研究番石榴多酚對食品的保鮮應用。本文可為番石榴的開發利用拓展范圍，以及提高番石榴的綜合利用率，增加番石榴的綜合利用價值，同時為研發天然多酚的抑菌藥物提供理論基礎。