不同產地浮小麥HPLC指紋圖譜研究

袁為玲，惠 明，田 青，黃繼紅

河南工業大學 生物工程學院，河南 鄭州 450001

禾本科植物小麥干癟輕浮的穎果稱為浮小麥(FructusTriticiLevis)。浮小麥性涼，味甘甜，作用于腎、脾、心，可止汗、除熱、益氣，對自汗、盜汗、骨蒸勞熱等疾病有較好的療效[1-2]。臨床廣泛用于更年期潮熱、盜汗、自汗、兒童汗癥等疾病的治療[3-6]。浮小麥資源豐富，在我國華北、華東、華中、東北等地區均有產出，目前從中先后檢測出亞油酸、5-二十一烷基間苯二酚、棉籽糖、葡萄糖、微量元素等多種化學成分，由于各產地地理位置、生態環境等條件不同，造成不同產地浮小麥化學成分含量具有差異性[7-11]?！吨袊幍洹?015年版中收錄浮小麥配伍藥方的用量及使用方法，但未對浮小麥質量控制提出明確要求[12]。在質量評價過程中只采用單一或幾個指標不足以表現浮小麥的整體特性，故作者選用不同產地浮小麥，運用相似度評價、聚類分析、主成分分析等方法進行指紋圖譜分析[13-21]，以期為浮小麥質量控制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

12批不同產地的浮小麥樣品(表1)均從中藥店采購。

表1 浮小麥樣品的來源

乙腈、甲醇、磷酸(色譜級)：天津科密歐化學試劑公司；純凈水：杭州娃哈哈集團有限公司；亞油酸(批號I1811018)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；豆甾醇(批號C10206967)：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LC-2030C Plus高效液相色譜儀:日本島津公司；超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司；旋轉蒸發儀:鄭州長城科工貿易有限公司；多功能高速粉碎機:荷蘭皇家飛利浦電子公司；電子分析天平:賽多斯科學儀器有限公司；高速冷凍離心機:賽默飛世爾(中國)科技公司；分樣篩:浙江上虞五四儀器篩具廠。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液的制備

精確稱取亞油酸、豆甾醇對照品適量，置于25 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻度，即得含有540 μg/mL豆甾醇、720 μg/mL亞油酸混合對照品的溶液。

1.3.2 樣品溶液的制備

精確稱取浮小麥1.000 g(過50目篩)，置于50 mL離心管并加入甲醇25 mL，在500 W、60 kHz超聲波下提取3次，每次30 min， 8 000 r/min離心15 min，取上清液，進行旋轉蒸發，殘渣加入甲醇溶解，轉移至10 mL容量瓶，并用甲醇定容，過0.22 um微孔濾膜，即得樣品溶液。

1.3.3 色譜條件

采用Material C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱進行分離，流動相為乙腈溶液(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～10 min，45%-35% A；10～25 min，35%-25% A；25～40 min，25%-15% A；40～60 min，15%-10% A；60～70 min，10%-3% A)，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，測定波長203 nm，進樣量20 μL。

1.3.4 數據處理

相似度評價采用“中藥指紋圖譜相似度評價系統(2012版)”，以S1為參照圖譜。使用SPSS 25.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 精密度試驗

取同一批S1樣品溶液，按照1.3.3的色譜條件連續進樣6次，以7號亞油酸為參照峰，考察儀器精密度。各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD分別為0.16%～1.89%、1.74%～2.22%，均小于3.00%，表明儀器精密度良好。

2.1.2 穩定性試驗

取同一批S1樣品溶液6份，分別在0、2、6、8、12、24 h后按照1.3.3的色譜條件進樣測定，以7號亞油酸為參照峰，計算其他共有峰的相對保留時間和峰面積。各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD分別為1.23%～1.60%、1.01%～2.15%，均小于3.00%，說明樣品溶液在制備24 h內穩定性良好。

2.1.3 重復性試驗

取同一批S1樣品溶液6份，按照1.3.3的色譜條件測定，以7號亞油酸為參照峰，計算其他共有峰的相對保留時間和峰面積。各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD分別為1.16%～1.25%、0.90%～1.90%，均小于3.00%，表明重復性良好。

2.2 指紋圖譜的建立

將12批浮小麥的樣品溶液在1.3.3的色譜條件下測定，將所得色譜圖導入“中藥指紋圖譜相似度評價系統(2012版)”，以S1樣品色譜圖為參照圖譜，選擇平均數法，時間寬度設置成0.1，多點校正后，進行共有峰自動匹配，生成樣品對照指紋圖譜和對照指紋圖譜R，見圖1、圖2，其中12批不同產地浮小麥共有色譜峰16個。通過與對照品進行比對，7號峰為亞油酸，11號峰為豆甾醇，見圖3。由于7號亞油酸峰分離度好，峰位居中，故以其為參照峰(S)計算其余共有峰的相對保留時間的RSD，均小于3.00%，表明共有峰的出峰時間較為穩定，但其相對峰面積的RSD相差較大，表明不同產地浮小麥中各個成分含量存在一定差異性，見表2。

表2 各共有峰相對峰面積

圖1 12批浮小麥樣品色譜峰匹配圖

圖2 浮小麥樣品HPLC指紋圖譜共有模式

圖3 對照品HPLC色譜圖

2.3 相似度評價

將12批浮小麥指紋圖譜導入“中藥指紋圖譜相似度評價系統(2012版)”中，以S1為參照圖譜進行相似度評價，結果見表3。12批不同產地浮小麥指紋圖譜相似度為0.936～0.996，均大于0.9，整體相似度較高，表明浮小麥性質較為穩定。

表3 不同產地浮小麥HPLC指紋圖譜的相似度

2.4 聚類分析

將12批樣品共有峰的相對峰面積作為原始數據導入SPSS 25.0軟件，采用平方歐式距離為樣品間距離計算方法，對數據進行標準化轉換，進行聚類分析，見圖4。根據藥材聚類分析結果，12批不同產地浮小麥可以被聚為3類，第1類: S8號樣品；第2類: S1、S4、S10號樣品；第3類: S2、S3、S5、S6、S7、S9、S11、S12號樣品。表明生產產地相同或地理位置相似的樣品被聚在一起，與相似度分析結果基本一致。

圖4 不同產地浮小麥聚類分析

2.5 主成分分析

為了進一步探討不同產地的浮小麥成分之間的差異性，在相似度和聚類分析的基礎上，對指紋圖譜所得到的16個共有峰的峰面積進行標準化處理，以標準化后的共有峰峰面積為變量，采用SPSS 25.0軟件進行主成分分析，結果見表4。選取前4個特征值>1的成分為主成分對浮小麥指紋圖譜進行描述，其累計方差貢獻率為86.621%，能夠較好地反映其化學成分特征。對主成分載荷值進行計算，得出主成分線性模型。并根據公式F=(0.33.642F1+0.272 64F2+0.179 75F3+0.077 40F4)/86.622(F代表主成分綜合得分，F1、F2、F3、F4分別代表4個主成分得分)計算綜合得分，見表5、表6。不同產地浮小麥綜合得分為-5.78～5.76，若以16個共有成分為綜合評價指標，其中山東、河南、山西浮小麥總體評分較高。主成分分析能把不同產地浮小麥分開，說明其質量存在差異。

表4 主成分特征值及累計方差貢獻率

表5 主成分矩陣

表6 不同產地浮小麥主成分得分和綜合得分

3 結論

從兼顧各個色譜峰的分離度、基線平穩度和色譜峰信息完全度出發，使用島津HPLC二極管陣列檢測器，考察了多個波長和4種不同體系的流動相，最終確定儀器檢測條件：以乙腈-0.1%磷酸水做流動相，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，在203 nm處進行指紋圖譜掃描。對12種不同產地浮小麥建立了指紋圖譜，其相似度為0.936～0.996，均大于0.9，可以表征浮小麥的特征屬性。通過CA和PCA分析12批樣品可聚為三類，其中山東、河南、山西產地浮小麥質量評價分數較高，其他地區浮小麥質量評價分數存在一定差異性，這可能與浮小麥生長環境、儲存條件等因素有關。該指紋圖譜的建立為浮小麥質量評價和合理應用提供了依據。